李林斌，吴冕，杨云稀，邵一鸣，刘璐，黄佳敏，孙炳伟

(南京医科大学附属苏州医院烧创伤中心，江苏 苏州 215004)

2型糖尿病是全球公共卫生问题，其发病率在全球范围内持续上升[1-2]，感染是其最常见的并发症之一。研究表明，2型糖尿病对某些特定病原体的易感性增加，其中细菌感染的发病率最高，如骨髓炎、肺炎或蜂窝织炎[3]，这与患者先天性免疫功能受损有关[4-5]。中性粒细胞是先天性免疫细胞中数量最多的，且在先天性免疫反应中第一个到达炎症部位[6]。2型糖尿病患者血糖升高刺激骨髓增生[7]，引起外周血中性粒细胞数量上升[8]。然而，患者中性粒细胞数量升高，抵御病原体的能力没有增强，提示患者中性粒细胞功能不全。本研究针对中性粒细胞发挥固有免疫最基本的趋化功能[9]进行分析，旨在为预防和治疗糖尿病患者感染性并发症提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 伦理声明

本研究获南京医科大学附属苏州医院(苏州市立医院)医学伦理委员会批准(批准号KL901064)。通过健康志愿者和2型糖尿病患者的肘静脉获取血液样本，在入组24 h内采集血样。在被纳入研究之前，所有参与者收到了书面知情同意书。所有的实验按照批准的指南进行。

1.2 研究对象

本研究为横断面研究，纳入2020年7月至12月在南京医科大学附属苏州医院内分泌科住院确诊的2型糖尿病患者45例。确诊标准为存在典型2型糖尿病症状且随机血糖≥11.1 mmol/L，或空腹血糖≥7.0 mmol/L，或葡萄糖负荷后2 h血糖≥11.1 mmol/L。同期于苏州市体检中心招募健康成人志愿者45名。患有感染、白细胞>10×109/L的患者及志愿者排除在外。受试者的临床特征见表1。

1.3 主要试剂与仪器

Hank平衡盐溶液(HBSS)、PBS、胎牛血清、RPMI 1640(新西兰Gbico公司)；Ficoll(瑞典GE公司)；糖基化终产物(AGEs，美国Abcam公司)；FITC标记抗P2X1受体抗体(以色列Alomone公司)；兔源P2X1受体一抗(英国Biorbyt公司)；FITC标记的链霉素二抗(中国BIOSS公司)；IX71荧光倒置显微镜(日本奥林巴斯公司)，FACS Canto Ⅱ流式细胞仪(美国BD公司)，Zeiss LSM 900共聚焦显微镜(德国蔡司公司)。其他试剂如无特殊说明均购自美国Sigma公司。

表1 受试者一般资料及临床信息 n=45

1.4 中性粒细胞分离

使用含EDTA的采血管收集受试者全血2 mL。1 ∶1加入3%葡聚糖沉降红细胞20 min。取上清液，离心10 min(400×g，20 ℃)后用1×HBSS(不含Ca2+、Mg2+)重悬细胞。将细胞悬液置于3 mL的Ficoll上，离心35 min(400×g，15 ℃)后弃上清液。沉淀用3 mL蒸馏水吹打30 s裂解红细胞，加入3 mL 2×HBSS，离心7 min(400×g，20 ℃)。重复裂解2次后获得纯化的人外周血中性粒细胞。纯化的中性粒细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640重悬备用。

1.5 中性粒细胞趋化功能分析

使用本课题组改良后的琼脂糖下趋化模型检测中性粒细胞趋化功能。 将煮沸的琼脂糖溶液与50% HBSS(含Ca2+、Mg2+)和50% RPMI 1640(含20% 胎牛血清)的培养基混合制成琼脂糖凝胶。然后用移液管将2.7 mL溶液移入35 mm培养皿中，在室温下冷却至凝固。当琼脂糖溶液完全凝固时，在凝胶中切出直径3 mm、相距2.8 mm的3个孔。中间孔填充0.1 μmol/L趋化肽(N-formyl-Met-Leu-Phe fMLP)10 μL，两侧孔填充1×107/mL中性粒细胞10 μL。凝胶在37 ℃、5% CO2培养箱中培养2 h。用IX71荧光倒置显微镜在四倍镜下观察趋化距离。

为分析趋化图像，本课题组建立了基于计算机视觉的细胞趋化分析系统。根据趋化距离将趋化区域划分了3个区，Ⅰ区：<800 μm，Ⅱ区：800～2 000 μm，Ⅲ区：>2 000 μm。设置了3个参数评价中性粒细胞趋化功能：趋化距离、趋化细胞比率、趋化指数。趋化细胞比率(%)=(趋化细胞数/总细胞数)×100%；趋化指数=(Ⅱ区+Ⅲ区细胞数)/总细胞数。

在趋化干预实验中，用RPMI 1640(含20%胎牛血清)将2型糖尿病患者及健康对照的血浆配制成90%和20%两组；将AGEs 配制成0.5、1、2和4 mmol/L；葡萄糖配制成5、12、25 mmol/L，25 mmol/L甘露醇为高渗透压对照组；棕榈酸配制成50、100和200 μmol/L。将处理后的中性粒细胞(1×107/mL)在37 ℃、5% CO2培养箱中孵育2 h(葡萄糖及棕榈酸干预实验孵育4 h)后用PBS洗涤2次后检测趋化功能。对照组用单纯培养基处理。

1.6 流式细胞术检测中性粒细胞表面P2X1受体

取纯化的人中性粒细胞5×105个(细胞密度为1×107/mL)，按5 μL/100 μL PBS加入FITC标记抗P2X1受体抗体，与中性粒细胞在4 ℃下避光共孵育1 h，用冷PBS洗涤2次后流式细胞术检测荧光强度。

1.7 免疫荧光检测中性粒细胞膜表面P2X1受体

将棕榈酸干预后的中性粒细胞(2×106个)用冷PBS洗涤2次，用4%多聚甲醛固定15 min，用0.01% Triton X-100渗透30 min，用5%山羊血清封闭1 h，用1 ∶200兔源P2X1受体一抗4 ℃孵育过夜后，1 ∶1 000 FITC标记的链霉素二抗室温避光孵育1 h。在细胞核染色过程中，细胞与DAPI共孵育30 min。染色后，使用共聚焦显微镜观察中性粒细胞。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 2型糖尿病患者中性粒细胞趋化功能受损

与健康对照相比，2型糖尿病患者中性粒细胞趋化距离、趋化细胞比率和趋化指数均明显下降(t分别为16.19、17.21、16.76，P均 <0.001)。见图1。

图1 2型糖尿病患者中性粒细胞趋化功能分析

2.2 2型糖尿病患者中性粒细胞膜表面P2X1受体表达增加

流式细胞术结果显示，与健康对照比较，2型糖尿病患者中性粒细胞P2X1受体表达水平明显升高(t=7.60，P<0.001)；对2型糖尿病患者中性粒细胞趋化距离与P2X1受体表达作相关性分析，结果显示二者呈负相关(r=-0.60,P<0.001)。见图2。

图2 2型糖尿病患者中性粒细胞膜表面P2X1受体表达及与趋化距离的相关性

2.3 中性粒细胞趋化功能受损机制分析

2.3.1 2型糖尿病患者高浓度血浆抑制中性粒细胞的趋化功能 90%和20%的患者血浆刺激健康对照中性粒细胞2 h后，3组趋化距离比较总体差异有统计学意义(F=46.75，P<0.001)，90%患者血浆组相较对照组(单纯培养基)和20%患者血浆组能明显抑制中性粒细胞趋化功能(P均<0.001)；而90%和20%的健康对照血浆刺激后，3组趋化距离的差异无统计学意义(F=0.42，P>0.05)。见图3。

a：P<0.001，与对照组相比；b：P<0.001，与20%患者血浆组比较

2.3.2 葡萄糖、AGEs、棕榈酸干预后中性粒细胞的趋化功能 在葡萄糖干预实验中以5 mmol/L组为对照组，12、25 mmol/L组为高浓度葡萄糖组，25 mmol/L甘露醇为高渗透压对照组。孵育中性粒细胞4 h后结果显示，4组趋化距离比较总体差异无统计学意义(F=1.47，P>0.05)。

以0.5、1、2和4 mmol/L的AGEs干预健康对照中性粒细胞2 h后，结果显示5组趋化距离比较总体差异无统计学意义(F=1.03，P>0.05)。

以50、100 和200 μmol/L棕榈酸干预健康对照中性粒细胞4 h后，4组趋化距离比较总体差异有统计学意义(F=3.52，P<0.05), 200 μmol/L组较对照组明显抑制中性粒细胞趋化功能(P<0.05)。见图4。

a：P<0.05，与对照组相比

2.3.3 棕榈酸促进中性粒细胞P2X1受体高表达 50、100 和200 μmol/L棕榈酸干预健康对照中性粒细胞后，流式细胞术检测结果显示，4组P2X1平均荧光强度比较总体差异有统计学意义(F=2.96，P<0.05)；与对照组相比，高浓度棕榈酸(200 μmol/L)明显促进中性粒细胞膜表面P2X1受体高表达(P<0.05)，趋化距离与P2X1表达呈明显负相关(r=-0.67，P<0.05)。200 μmol/L棕榈酸干预中性粒细胞4 h，免疫荧光法检测膜表面P2X1受体表达，结果与流式细胞术一致。见图5。

A：流式细胞术检测P2X1受体；B：趋化距离与P2X1表达的相关性；C：免疫荧光检测P2X1受体(×100)。a：P<0.05，与对照组相比

3 讨论

胰岛素抵抗是2型糖尿病显著的病理生理学特征。研究表明，大多数胰岛素抵抗患者存在肥胖和血脂升高[10-12]，其中肥胖引起的慢性炎症可能在胰岛素抵抗中起到重要作用[13]，炎症因子通过脂肪和肌肉组织中的IKKβ/NF-κB 和 JNK 通路促进胰岛素抵抗的发生[14]。中性粒细胞是先天性免疫细胞中数量最多的[15]，在抗感染中的作用十分重要，其趋化性是指沿着吸引物或排斥物浓度梯度的方向运动的性质[16]。趋化功能正常是中性粒细胞定向迁移至感染部位的前提，趋化功能障碍会造成机体严重的免疫功能缺陷[17]。本研究结果表明高浓度棕榈酸对中性粒细胞的趋化性存在抑制作用，这损害了机体抵御病原体和对炎症的清除功能，导致机体慢性炎症发生，加重了患者胰岛素抵抗，对2型糖尿病的发生发展有一定的推动作用。

本研究中，2型糖尿病患者的高浓度血浆能明显抑制中性粒细胞趋化功能。2型糖尿病患者因代谢功能紊乱，血浆中血糖、AGEs[18]、棕榈酸[19]等物质明显升高，这些因素均可能是患者中性粒细胞趋化功能受损的原因。然而，高浓度葡萄糖不能明显抑制中性粒细胞趋化功能。除高浓度葡萄糖对中性粒细胞趋化功能无明显作用外，另一可能的原因是本实验干预时间较短。葡萄糖是中性粒细胞的供能物质，短时间的高糖干预甚至可能是中性粒细胞趋化作用的有利因素。然而，中性粒细胞在体外半衰期只有8 h[20]，因此体外实验很难模拟出2型糖尿病患者体内中性粒细胞长时间受到高糖刺激的条件。Collison等[21]证明了中性粒细胞膜上存在AGEs受体，能与中性粒细胞结合并引起胞内Ca2+一过性升高。受此启发，本研究使用AGEs干预中性粒细胞，但未得出AGEs明显抑制中性粒细胞趋化功能的结论。

本课题组在先前的研究中发现细菌内毒素刺激中性粒细胞后，激发中性粒细胞自分泌ATP，顺序活化ATP/P2X1/Ca2+信号通路，导致细胞骨架肌球蛋白轻链异常磷酸化及极性化，最终抑制中性粒细胞趋化功能[22]。在本研究中，高浓度棕榈酸明显抑制中性粒细胞的趋化功能，促进中性粒细胞表面P2X1受体表达升高，二者呈负相关。可见棕榈酸在抑制中性粒细胞趋化功能方面表现出了类似内毒素的作用，同时又与患者存在的慢性炎症互为因果。该结论提示，在2型糖尿病患者感染的防治工作中，血脂代谢异常的负面影响不容忽视。同时，中性粒细胞P2X1受体在延缓2型糖尿病患者疾病进程以及治疗感染并发症中或可作为重要靶点发挥作用，其对中性粒细胞趋化功能的调控，对改善2型糖尿病患者的慢性炎症状态具有巨大潜在应用前景。

多数临床工作者对中性粒细胞的关注仅停留在计数上，用于辅助诊断炎症感染状态，而中性粒细胞最为重要的趋化、杀菌等功能往往被忽视。本研究结果表明，在2糖尿病患者感染相关的诊疗中，相较于感染发生后的抗感染治疗，及早调节脂质代谢，可减轻脂质代谢异常对中性粒细胞造成的损害，增强患者抗感染能力。

综上所述，2型糖尿病患者中性粒细胞趋化功能发生障碍，棕榈酸通过中性粒细胞P2X1受体抑制中性粒细胞趋化功能。P2X1受体或可作为一种新的检测指标和靶点，对于预警和治疗2型糖尿病患者感染并发症具有很好的临床意义。