闫鹏东，付 盟，韦洁敏，张国彦，崔浪军

(1.西北濒危药材资源开发国家工程实验室/药用资源与天然药物化学教育部重点实验室/陕西师范大学 生命科学学院，陕西 西安 710119；2.延安大学 生命科学学院，陕西延安 716000；3.城固县群利中药材合作社，陕西 汉中 723200)

附子是毛茛科植物乌头(AconitumcarmichaeliDebx.)的子根，是我国著名的传统大宗中药材之一。附子始载于《神农本草经》，被誉为“回阳救逆第一品药”。附子因其具有抗炎、镇痛、强心、抗心律失常、降血糖、抗癌、免疫抑制等药理作用[1]，被广泛用于医药、食疗行业。随着近年来我国中医药行业的升温，以及附子的相关药理学研究的深入，市场对附子的需求量逐步增加，全国附子的种植面积也随之增加。磷是植物生长和繁殖过程中所必需的基本营养元素之一，对植物的生长发育、产量形成、品质改善具有重要意义[2, 3]。磷肥包括磷酸二氢钾、过磷酸钙、钙镁磷肥等多种，不同的磷肥对不同的作物产量和品质影响不同[4, 5]。磷肥施入土壤，经溶解和水解作用，以不同形式的磷酸离子存在，易被土壤吸附、固持，加之一些土壤微生物将磷肥转化为作物不易吸收的有机形式，使磷肥在土壤中表现为低利用性，因此在生产实践中常投入过量磷肥。过量的使用磷肥不仅造成肥料肥效降低、作物收益减少、作物品质下降等问题，还引起水土安全隐患[6, 7]。因此农业生产中，需要根据作物种类科学选择合适的磷肥以及合适的施肥量。

目前附子以陕西、四川和云南等地为主产地，经笔者走访，当地药农在附子栽培过程中大量使用磷肥，但施用的磷肥种类和效果各异。科学选择磷肥在最大可能提高附子产量与品质的同时，对于降低磷肥的施用量、保护水土安全意义重大。而目前关于附子对磷肥种类的偏好和用量上缺乏系统研究。基于此，本研究在盆栽条件下，研究了三种磷肥在不同施肥水平下对附子产量、农艺性状以及品质的影响，以期为附子合理施加磷肥提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试附子种质：试验前一周自附子道地产区汉中采挖附子种根，挑选无焦巴、霉烂、锄伤、水漩及缺芽的大小均一的二级种根用于试验。种根经形态学鉴定及薄层色谱鉴定[8]为A.carmichaeliDebx.的子根。

主要试验试剂：甲醇、乙腈、乙酸铵、甲酸均购于美国Fisher Chemical，生物碱对照品均购于成都曼斯特生物科技有限公司，磷酸二氢钾(P2O5=52%)购于什邡华蓉科技有限责任公司，过磷酸钙(P2O5=18%)购于山东科达化肥有限公司，钙镁磷肥(P2O5=17%)购于广西鹿寨化肥有限责任公司，碳酸氢铵、硫酸钾、以及其余试剂均购于天津天利化学试剂有限公司。

主要试验仪器：岛津LC-2030高效液相色谱仪(日本岛津株式会社)，Tecan Infinit® F50酶标仪(上海帝肯贸易有限公司)。

1.2 试验设计

2017年10月在陕西师范大学长安校区试验田进行盆栽试验。首先，将除去草根、石头等杂物并充分搅拌均匀的中性壤土装入直径35 cm、高40 cm的塑料盆中，共装100盆。再将所有盆施入等量的氮肥(NH4HCO3：21.33 g和钾肥(K2SO4：2.097 g)。随后将这些盆随机分为10组，每组10个重复，随机选取一组作为不施任何磷肥的空白对照组，剩余9组以P2O5含量为基准按照表1方案进行施肥处理。

表1 磷肥试验方案

1.3 农艺性状测定

所有附子于2018年10月15日采挖。采挖前，量取附子株高和茎粗，采挖后统计每个植株的附子个数，将附子洗净、晾干后，测量其最大附子直径、最小附子直径、最大附子重量和最小附子重量。

1.4 附子产量、可溶性蛋白含量、多糖含量测定

统计完附子农艺性状后，随机取4个植株的附子，放置于60 ℃的烘箱中烘干至恒重，称量干重并计算出每株产量。随后将干燥后的附子粉碎过100目筛，搅拌均匀，取适量粉末用考马斯亮蓝法[9]测定其可溶性蛋白含量，同时取部分粉末用蒽酮-硫酸法[10]测定其多糖含量，剩余粉末在室温下保存备用。

1.5 附子生物碱测定

采用高效液相色谱法(HPLC)测定生物碱含量。

1.5.1 液相色谱条件 色谱柱为Venusil XBP C18 (L)，规格为4.6 mm×250 mm×5 μm。

流动相A液为含0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸铵溶液，B液为乙腈。

洗脱程序：柱温35 ℃；流速1 mL/min；进样量10 μL；梯度程序为0 min时0%B液，3 min时8%B液，10 min时20%B液，15 min时25%B液，30 min时50%B液。

1.5.2 对照品制备 精密称取盐酸多巴胺、去甲猪毛菜碱、宋果灵、多根乌头碱、棍掌碱、塔拉萨敏、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、乌头碱、次乌头碱这12种标准品，分别置于25 mL容量瓶中，加0.05 mol/L盐酸溶液定容至25 mL，配制成浓度为0.5 mg/ml的标准品对照溶液。取上述12种对照品溶液各1 mL至25 mL量瓶中，加0.05 mol/L盐酸溶液定容至25 mL，得混合对照品贮备液。

1.5.3 供试品制备 将附子干燥、粉碎、过100目筛后混匀。精密称取附子粉末1.0 g，加入5 mL 0.05 mol/L盐酸溶液，摇匀，超声30 min，于3 000 r/min离心10 min。精密量取上清液0.5 mL，用甲醇定容至2.5 mL，用0.22 μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

1.5.4 建立标准曲线 取对照品储备液适量，用色谱甲醇稀释成不同浓度梯度的对照品溶液，在拟定的HPLC条件下测定。以待测物的质量浓度为横坐标X，待测物的峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，计算各生物碱回归方程及其相关系数。

1.5.5 方法学验证 精密度试验、稳定性试验、重复性试验、加样回收率试验参考唐进法文章[11]进行验证。

1.6 数据分析方法

采用Excel 2019、SPSS 23、GraphPad Prism 8进行组间差异分析，综合评价分析。

2 结果与分析

2.1 附子农艺性状结果

表2为不同处理下的附子农艺性状。从表2中可以看出，茎粗、单株附子个数、最小附子直径在各处理下虽有变化但彼此间无显著差异(P>0.05)。与对照组相比，株高在低水平钙镁磷肥处理下显著增长(P< 0.05)，其余处理均无显著变化；最大附子重量在低、中水平钙镁磷肥处理下增加最多，但与对照组相比无显著差异；最大附子直径在中水平钙镁磷肥处理下最大，低水平钙镁磷肥处理次之，但与对照组相比均无显著差异。最小附子重量在施肥后全部减少，以中水平钙镁磷肥处理下减少的最少，且与对照组相比无显著差异，其余处理与对照相比均显著减少。

表2 不同处理下的附子农艺性状

2.2 附子产量、可溶性蛋白含量、多糖含量结果

图1为不同处理下的附子产量、可溶性蛋白含量和多糖含量。在产量方面，高水平磷酸二氢钾处理下产量最高，中水平钙镁磷肥产量次之，两者与空白对照组相比均显著增加。在低水平过磷酸钙处理下产量最低，高水平钙镁磷肥处理次之，与对照组相比均极显著减少(P< 0.01)。在可溶性蛋白含量方面，与对照组相比其在所有处理下均增加，除高水平磷酸二氢钾、高水平过磷酸钙处理无显著差异外，其余处理都为显著增加，且以低水平磷酸二氢钾处理增加最多。在附子多糖含量方面，与对照组相比低、中、高水平磷酸二氢钾处理的附子多糖含量均为极显著增加，其余处理均有减少，其中以高水平钙镁磷肥处理减少最多，为极显著减少。

图1 不同处理下的附子产量(A)、可溶性蛋白含量(B)、多糖含量(C)

2.3 附子生物碱含量结果

2.3.1 附子生物碱标准曲线与液相色谱方法学验证结果 附子各生物碱标准曲线回归方程及其相关系数结果见表3。

方法学验证结果见表3，其中精密度试验结果显示12种生物碱精密度RSD在1.05%～3.99%之间，稳定性试验RSD在1.38%～4.89%之间，重复性试验RSD在1.38%～4.23%之间，加样回收率试验回收率在97.64%～101.75%之间，RSD在1.01%～4.53%之间，这些表明该方法精密度良好，重复性良好，且供试品溶液在在24 h内基本稳定。

表3 生物碱含量回归方程、相关系数以及方法学验证

2.3.2 附子生物碱含量结果 表4为不同处理下的各种生物碱的含量。与对照组相比，其中盐酸多巴胺在处理后全部显著增加，且以低水平钙镁磷肥处理增加最多，高水平磷酸二氢钾处理次之；去甲猪毛菜碱除在中水平磷酸二氢钾处理略有减少、高水平钙镁磷肥处理显著减少外，其余处理下均增加，且在低、中水平钙镁磷肥处理下显著增长，并以中水平钙镁磷肥处理增加最多；宋果灵则在处理后全部显著降低，其中以中水平磷酸二氢钾、低、中水平钙镁磷肥处理降低最少；多根乌头碱在处理后除高水平磷酸二氢钾轻微增长外，其余皆为显著增加，且以中水平钙镁磷肥、高水平过磷酸钙处理下增加最多；棍掌碱在低、中水平磷酸二氢钾处理下降低，其余处理下均增加，其中低、高水平过磷酸钙、低水平钙镁磷肥处理显著增加；塔拉萨敏在处理后只有中水平过磷酸钙、低、中水平钙镁磷肥略有增加，其余均为减少，但整体无显著差异；苯甲酰新乌头原碱除在低、中水平磷酸二氢钾处理下显著减少外，其余处理下均显著增加，以低水平钙镁磷肥增加最多；苯甲酰乌头原碱除在低、中水平磷酸二氢钾处理下显著增加外，其余处理下变化不大；苯甲酰次乌头原碱在处理后均显著增加，以中水平钙镁磷肥处理增加最多，低水平钙镁磷肥次之；新乌头碱在在低、中水平钙镁磷肥处理下增加最多，高水平钙镁磷肥处理下减少最多，但整体上均无显著差异；乌头碱在中水平钙镁磷肥处理下显著增加，其余处理均减少，其中在高水平过磷酸钙、高水平钙镁磷肥、中水平磷酸二氢钾处理下显著减少；次乌头碱除在低、中水平钙镁磷肥处理后无显著变化外，其余处理均显著降低，并以高水平钙镁磷肥减少最多。

表4 不同处理下的附子生物碱含量 (mg/g)

整体来看，总双酯型生物碱在处理后，除高水平钙镁磷肥显著减少外，其余处理下虽有所减少，但都无显著差异，并以中、低水平钙镁磷肥处理减少最少；总单酯型生物碱在处理后均上升，除低水平磷酸二氢钾无显著差异外，其余均显著增加，其中以低水平钙镁磷肥增加最多；总生物碱在处理后均有所增长，其中中水平钙镁磷肥、低水平过磷酸钙、低水平钙镁磷肥、高水平过磷酸钙处理下显著增加，其余处理无显著差异。

2.4 主成分分析结果

通过SPSS软件，将所有试验附子的产量、株高、多糖含量、盐酸多巴胺含量等22项指标的数据采取标准化处理进行主成分分析。以特征值大于1提取了六个主成分，其累积方差贡献率为89.542%，可代表原始数据的绝大部分信息，其中主成分特征值及方差贡献率见表5，成分矩阵见表6。

表5 主成分的特征值及方差贡献率

表6 成分矩阵

表7 得分及排名

以综合得分来看，不施磷肥的对照组排名最低，施加低、中、高水平磷酸二氢钾的排名为第6、7、3，施加低、中、高水平过磷酸钙的排名为5、4、8，施加低、中、高水平钙镁磷肥的排名为2、1、9。

3 讨论

3.1 不同处理对附子农艺性状和产量的影响

在本试验中，笔者发现施加了高水平磷酸二氢钾的单株附子个数最多，并且产量为最好。施加了中水平钙镁磷肥的附子个头最大，产量也有明显提升。而施加了过磷酸钙后的附子产量全部降低。

笔者推测可能是由于磷酸二氢钾作为一种特殊的磷肥，在高水平处理时引入了一定量的钾元素，促进附子根系的生长，使附子个头和个数增多，从而提高了附子的产量，在戴维等人的研究中发现，钾元素对附子有着良好的增产效果[14]，这与笔者的试验现象吻合；钙镁磷肥为枸溶性磷肥[15]，肥效长，能提供一定的钙、硅、硫、镁等有益元素[16]，从促进附子的生长，使其性状与产量都较好；过磷酸钙为水溶性速效肥，其有效成分移动慢、移动距离短、易被固定的特定，其在施用时需尽量与作物根系接触，在唐莉等人的研究中发现尿素施用过多会“烧伤”附子种根创口[17]，经查阅文献，过磷酸钙也有类似烧苗的现象[18]，而附子用块根繁殖，推测施加过磷酸钙时对附子创口造成了伤害，从而导致附子种根生长状态差，进而引起产量降低。

整体来看，中、低水平钙镁磷肥和高水平磷酸二氢钾能有效提升附子的性状与产量。

3.2 不同处理对附子品质的影响

药用植物的品质主要是由其化学成分决定的[19]。在当前研究中，附子可溶性蛋白作为一种潜在的有效化学成分[20]，目前研究较少。在本试验中，附子可溶性蛋白含量在所有处理后均增加，以低水平磷酸二氢钾处理效果最好，各水平钙镁磷肥处理效果也比较好，其余一般。

附子多糖具有调节免疫、保护心肌细胞、降血糖降血脂等作用[1]，是近年来的附子药理研究的热点。笔者在此次施肥试验中发现，附子多糖含量在磷酸二氢钾处理中全部极显著增加，而在过磷酸钙、钙镁磷肥组中全都降低，并在高水平时均为极显著降低。目前有学者在研究施肥对黄精多糖含量影响时发现，磷肥对多糖的合成影响为负效应，钾肥对多糖合成影响为正效应，同时发现黄精多糖的合成需要一个较为稳定的营养环境，施肥过多或过少均会导致多糖含量降低[21]。这与笔者的试验现象较为一致。由此推断，较好的多糖含量，需要在施磷肥的同时增施一定的钾元素，且要使其保持在稳定水平。

生物碱是附子的主要药用化学成分，具有强心、抗炎、镇痛等多种功效[1, 22]，研究不同磷肥在不同施肥量下对其含量的影响具有重要意义。在张燕对益母草的施肥试验[23]和邓秋林对瓦布贝母的施肥试验[24]中，发现施加过磷酸钙后作物总生物碱含量增加，同时岳聪慧在土壤营养成分与附子生物碱含量的关系研究中发现，土壤速效磷与总生物碱存在显著正相关[25]，这些表明磷肥能促进生物碱的合成，这与笔者的试验结果一致。同时笔者在试验中发现，中水平钙镁磷肥处理时，去甲猪毛菜碱、多根乌头碱、塔拉萨敏、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、乌头碱、次乌头碱含量都比较高，且总生物碱含量最高。在低水平钙镁磷肥处理时，盐酸多巴胺、去甲猪毛菜碱、宋果灵、棍掌碱、塔拉萨敏、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、次乌头碱含量也比较高。由此推断，中、低水平的钙镁磷肥对附子生物碱的合成具有促进效果。

3.3 基于主成分分析的附子施肥效果综合评价

主成分分析法是一种降维分析，能将多个指标转化成彼此相互独立的几个主成分，同时在转化过程中产生能反映主成分信息量的权数。以此来计算综合评价值，可以在一定程度上克服主观盲目性，进而客观地反映样本间的真实关系[26]。

在基于主成分分析的附子施肥效果综合评价中，中水平钙镁磷肥处理排名最高、低水平钙镁磷肥次之、高水平磷酸二氢钾排第3。同时，不施磷肥的对照组最差，排名第10。结合前面施肥对附子农艺性状、产量和品质的影响分析，此主成分分析清晰的将综合施肥效果展示了出来，并且和农艺性状、产量、品质数据相互印证。

4 结论

综上来看，施磷肥时应首先考虑施用钙镁磷肥，以中水平的施肥量最好，低水平次之。同时也应注意到，施加高水平钙镁磷肥时，其对附子的综合效果变差，因而要避免使用高水平的钙镁磷肥。因而笔者今后的研究目标将是细化钙镁磷肥的施肥用量梯度，以寻找最适合附子生长的最佳钙镁磷肥施用量。