招丽君　梁咏梅　杨妹妹　蒋腾川　罗坤炽　林 洪　梁云飞　兰 星

HPSEC法检测注射用血栓通（冻干）高分子杂质

招丽君1梁咏梅1杨妹妹1蒋腾川2罗坤炽1林 洪1梁云飞1兰 星1

（1.广西梧州制药（集团）股份有限公司，广西 梧州 543002；2.广西中恒创新医药研究有限公司，广西 南宁 530000）

目的：考察注射用血栓通生产过程关键点及制剂高分子杂质的变化情况，明确去除高分子杂质的关键工艺点。方法：采用凝胶色谱法，色谱柱TSK SWXL2000，7.8 mm×300 mm，6 µm，等度洗脱；流动相：乙腈：0.1%三氟乙酸=27∶73；流速：0.5 mL/min；柱温：25℃，检测波长：214 nm。结果：相对分子量对数与保留时间标准曲线r值为0.97，分子量在1638～66430范围内呈良好的线性关系，30批注射用血栓通（冻干）未检测出高分子杂质，三七总皂苷纯化过程步骤C为去除高分子杂质关键步骤。结论：建立的高分子杂质检测方法准确、简便，可作为注射用血栓通制剂及生产过程中间体的内控方法。

凝胶色谱；高分子杂质；生产工艺

引言

中药注射剂是以现代科技手段，从中药中提取药物有效成份制备而成的制剂，近年来虽在临床应用上得到广泛的推广，但在应用过程中不良反应的报道屡见不鲜。有学者们[1-4]认为中药注射剂中高分子杂质为不良反应的重要物质之一，国家对中药注射剂安全性再评价工作要求中也明确提出对中药注射剂生产过程高分子杂质的控制要求。注射用血栓通（冻干）主要治疗心脑血管疾病，为临床常用中药注射剂之一，本文拟通过开展注射用血栓通（冻干）制剂及生产过程的高分子杂质研究，为其安全性再评价提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Aglient1200高效液相色谱仪，百万分之一电子天平（型号：XP56，厂家：METTLER TOLEDO）；万分之一电子天平（型号：XPE204，厂家：METTLER TOLEDO）。

1.2 材料

生长抑素（分子量1638，批号：140656-201705）；

胸腺肽α1（分子量3108，批号：140655-201705）；

人胰岛素（分子量5808，批号：140654-201705）；

核糖核酸酶A（分子量13700，批号：140653-201705）；

（牛）血清白蛋白（分子量66430，批号：140619-201120）。以上对照品均购于中国食品药品检验所。

30批注射用血栓通（冻干）；30批三七总皂苷（粉针）；30批工序F样品；25批工序E样品；20批工序D样品；20批工序C样品；20批工序B样品；20批工序A样品。以上均由广西梧州制药集团（股份）有限公司提供。

三氟乙酸（色谱纯，山东西亚化学股份有限公司，批号：U20229）；

乙腈（色谱纯，厂家：DIKMA公司）；水（Millipore）。

2 方法

2.1 色谱条件

色谱柱：TSK SWXL2000，7.8 mm×300 mm，6 µm，等度洗脱，流动相；乙腈：0.1%三氟乙酸=27∶73；流速：0.5 mL/min；柱温：25℃，检测波长：214 nm。

2.2 对照品溶液配制

取生长抑素、胸腺肽α1、人胰岛素、核糖核酸酶A及（牛）血清白蛋白对照品各4 mg，精密称定，置5 mL容量瓶，0.025%三氟乙酸水溶液溶解并定容至刻度，得胸腺肽分子量标准混合对照母液。各分子量浓度分别为：生长抑素的浓度为1.192 mg/mL；胸腺肽的浓度为1.144 mg/mL；人胰岛素的浓度为1.136 mg/mL；核糖核酸酶A 的浓度为0.776 mg/mL；牛血清白蛋白的浓度为0.808 mg/mL。

2.3 供试品配制

（1）取注射用血栓通（冻干），精密称定250 mg至5 mL容量瓶，用超纯水超声溶解10 min并定容至刻度，得浓度为50 mg/mL的供试品溶液，0.45 μm滤膜过滤，滤液直接作为供试品。

（2）取三七总皂苷，精密称定250 mg，用超纯水溶解至5 mL容量瓶中，超声溶解10 min，稀释至刻度，0.45 μm滤膜过滤，滤液直接作为供试品。

（3）取工序F样品，精密吸取1 mL置10 mL容量瓶，加少量超纯水，超声溶解10 min，稀释至刻度，经0.45 μm滤膜过滤，续滤液直接作为供试品。

（4）分别在工序A、B、C、D、E，取同工序平行的两份样品，各取1 mL，置5 mL圆底离心管，涡旋1 min混匀，用0.45 μm滤膜过滤，续滤液直接作为供试品溶液。

3 结果

3.1 方法学验证

3.1.1 胸腺肽分子量标准标准曲线建立

取混合对照品溶液，注入高效液相色谱10 μL，记录各对照品的保留时间，以各分子量对数值与保留时间作线性回归。以色谱峰保留时间为横坐标，分子量对数为纵坐标，作线性回归，胸腺肽分子量标准混合对照溶液的标准曲线r值为0.97，分子量在1638～66430范围内呈良好的线性关系，如表1和图1所示。

表1 各分子量分子对数与保留时间

图1 胸腺肽分钟量标准相对分子量对数-保留时间标准曲线

3.1.2 重复性试验

根据色谱排阻法的原理，物质的分子量大小由保留时间决定，物质的含量由峰面积决定，因此，验证胸腺肽分子量方法的精密度及稳定性时，以保留时间及峰面积作为指标考察。

取混合对照溶液，注入Aglient1200高效液相色谱仪6次，计算混合对照品溶液各组分的保留时间及峰面积RSD。结果表明胸腺肽分子量标准各分子量保留时间重复性均少于0.2%，峰面积重复性均小于0.5%，表明方法的重复性较好，结果见表2与表3。

表2 各分子量的保留时间的重复性(±，n=6)

表2 各分子量的保留时间的重复性(±，n=6)

123456均值RSD 牛血清白蛋白核糖核酸酶A人胰岛素胸腺肽a1生长抑素11.23812.22314.08214.89516.05111.2412.22414.0814.89316.04811.2412.22514.08114.89516.04911.23812.22314.07614.88916.04411.23712.22114.07414.88716.04111.23712.22314.07614.88916.04311.238 ±0.00112.223 ±0.00114.078 ±0.00314.891 ±0.00316.046 ±0.0040.0120.0110.0230.0230.024

表3 各分子量的峰面积的重复性(±，n=6)

表3 各分子量的峰面积的重复性(±，n=6)

123456均值RSD 牛血清白蛋白核糖核酸酶A人胰岛素胸腺肽a1生长抑素3055.5762407.9696140.7892101.7917672.1253071.0482409.4186137.8742101.1187673.7443070.4572408.3246133.4802100.1507670.8923071.9942408.1846131.4572100.5877672.2713072.5732407.6346128.9552096.9727670.1363076.8932412.6006135.7332099.7337681.1383069.757±7.3092409.022±1.8546134.715± 4.3182100.058± 1.6767673.384± 3.9960.2380.0770.0700.0800.052

3.1.3 稳定性试验

取混合对照溶液，分别在0 h、6 h、12 h、24 h注入Aglient1200高效液相色谱仪3次，计算胸腺肽混合对照品溶液各组分的保留时间及峰面积RSD。各分子量24 h内的保留时间RSD均小于0.2%，峰面积RSD均小于0.5%，表明高分子杂质在24 h内稳定，结果见表4与表5。

表4 胸腺肽分子量标准各分子量保留时间稳定性(±，n=12)

表4 胸腺肽分子量标准各分子量保留时间稳定性(±，n=12)

牛血清白蛋白核糖核酸酶A人胰岛素胸腺肽a1生长抑素 0 h11.23811.2411.2412.22312.22412.22514.08214.0814.08114.89514.89314.89516.05116.04816.049 6 h11.23411.23211.23412.21112.21112.21214.05514.05914.05814.86814.87114.8716.01916.02416.022 12 h11.23311.23411.23212.20812.20812.20714.05214.05114.04914.86414.86314.86216.01416.01316.012 24 h11.22811.22711.23312.19112.1912.19614.02614.02714.03314.8414.84114.84615.98615.98815.993 均值11.234±0.00412.209±001214.054±0.02014.867±0.01916.018±0.023 RSD0.0360.0970.1390.1310.141

表5 胸腺肽分子量标准各分子量峰面积稳定性(±，n=12)

表5 胸腺肽分子量标准各分子量峰面积稳定性(±，n=12)

牛血清白蛋白核糖核酸酶A人胰岛素胸腺肽a1生长抑素 0 h3055.576 2407.969 6140.7892101.7917672.125 3071.0482409.4186137.8742101.1187673.744 3070.4572408.3246133.4802100.1507670.892 6 h3064.573 2406.512 6126.7412094.854 7671.959 3069.8782410.0376131.5512094.1587673.201 3072.5512410.8836129.1422098.4307675.805 12 h3070.587 2408.8796141.0752096.202 7688.071 3079.1102411.4036146.0302096.6237691.791 3075.3032409.4836140.5782096.2927688.784 24 h3073.372 2414.348 6165.1002097.191 7711.257 3081.6092419.4946168.1772096.4337721.091 3081.5132414.4646162.2062096.8797709.268 均值3072.131±7.2672410.934±3.5966143.562±14.1912097.510±2.3957687.332±17.763 RSD0.2370.1490.2310.1140.231

3.2 供试品检测

取混合对照液10 μL及注射用血栓通（冻干）、三七总皂苷（粉针）、工序A、B、C、D、E、F等供试品溶液各20 μL，记录供试品是否在对照品保留时间范围内出现高分子色谱峰。如出现高分子杂质色谱峰，按面积归一化法计算含量。

30批的注射用血栓通（冻干）及三七总皂苷（粉针）供试品均未在混合对照品保留时间范围内检测出高分子杂质峰；对工序样品的高分子杂质检测，工序A、B、C样品均在混合对照品保留时间范围内检测出高分子杂质，且随着工艺的逐步纯化，高分子杂质的含量逐渐减低，从工序B到工序C这一工艺步骤，能有效控制高分子杂质。结果见表6，图2至图9。

表6 注射用血栓通（冻干）制剂其及生产中间体高分子杂志检测结果

图2 注射用血栓通（冻干）高分子杂质检测色谱图

图3 三七总皂苷高分子杂质检测色谱图

图4 工序F样品高分子杂质检测色谱图

图5 工序E样品高分子杂质检测色谱图

图6 工序D样品高分子杂质检测色谱图

图7 工序C样品高分子检测色谱图

图8 工序B样品高分子杂质检测色谱图

图9 工序A样品高分子杂质检测色谱图

4 讨论

（1）目前多篇文献报道[5-9]中，中药注射剂高分子杂质检测的方法主要以胸腺肽分子量标准品为对照品，凝胶色谱法检测，参考文献方法，以乙腈和三氟乙酸作为流动相，建立注射用血栓通制剂及中间产品的高分子杂质检测方法。因胰岛素不溶于水，同时保证胎牛血清蛋白在溶剂的稳定性，因此采用0.025%三氟乙酸水溶液作为对照品溶剂。

（2）供试品的检测浓度设计在50 mg/mL，考虑到高分子杂质可能是极微量的存在，当其含量太低时，仪器未能检测出而造成假阴性现象，因此实验设计血栓通在高浓度下是否还残留着高分子杂质，进而推断血栓通在规定使用量下是否有残留的高分子杂质。30批的注射用血栓通（冻干）及三七总皂苷（粉针）供试品均未在混合对照品保留时间范围内检测出高分子杂质峰，推测注射用血栓通（冻干）及三七总皂苷的高分子杂质在生产过程通过纯化工艺被有效除去。

（3）通过对原料药三七总皂苷关键工序样品的高分子杂质检测，明确了其在纯化过程的高分子杂质去除情况。随着工艺的逐步纯化，高分子杂质的含量逐渐减低，而工序B到工序C这一工艺步骤，杂质则被有效控制，推测为重要除杂步骤。

5 结束语

本文建立注射用血栓通（冻干）高分子杂质检查的检测方法，控制产品在生产过程及储存过程高分子杂质的引入或残留，降低产品的风险性。

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Detection of Macromolecular Impurities in Xueshuantong (Lyophilized) for Injection by HPSEC

Objective: To investigate the key points in the production process of Xueshuantong for injection and the changes of macromolecular impurities in the preparation, and to clarify the key process points for removing macromolecular impurities. Methods: Gel chromatography was performed on the column TSK SWXL2000, 7.8 mm×300 mm, 6 μm, isoocratic elution, mobile phase: acetonitrile: 0.1% trifluoroacetic acid =27∶73; flow rate: 0.5 mL /min; column temperature: 25℃ and the detection wavelength: 214 nm. Results: The r value of the standard curve between the logarithm of relative molecular weight and retention time was 0.97, and the molecular weight showed a good linear relationship in the range of 1638～66430. No macromolecular impurities were detected in 30 batches of Xueshuantong(lyophilized) for injection,and step C of the purification process of Panax notoginseng saponins was the key step to remove macromolecular impurities. Conclusion: The established method is accurate and simple, and can be used as an internal control method for Xueshuantong preparation for injection and intermediates in the production process.

gel chromatography; macromolecular impurities; production process

O657

A

1008-1151(2022)01-0035-05

2021-09-20

广西三七综合利用技术重点实验室，注射用血栓通标准化建设（2YBLH-C-GX-09）。

招丽君（1986－），女，广西梧州制药（集团）股份有限公司工程师，从事中药研究相关工作。