嵇如月，于 新，赵晨蕊，何成彦，方 玲

(吉林大学中日联谊医院 检验科，吉林 长春130033)

结直肠癌是世界第三大最常见癌症[1]。其发病率和死亡率在全球范围内不断增加，仅2020年全球结直肠癌新发病例为193.16万，死亡病例93.52万,因此迫切需要降低发病率和死亡率[2]。本实验通过二维色谱质谱联用技术(LC-MS)及免疫印迹探究TOMM40在结直肠癌组织及癌旁组织的表达及意义，为结直肠癌的筛查和诊断提供一个新的方向。

1 材料与方法

1.1 一般资料

本研究所选用的结直肠癌及配对癌旁组织标本经病理医师确认均为DukesB期腺癌，共16对，来源于胃肠外科手术切除，标本采集时间段为2018年1月到2020年12月，所有患者均签署了知情同意书，且保证术前没有经过任何方式治疗。组织获取后用事先预冷的PBS冲洗干净，去除坏死组织及血液，迅速进行液氮速冻，然后放在-80℃冰箱保存，以备后续实验使用。

1.2 仪器与试剂

高效液相色谱仪，TPCK修饰的测序级胰酶，NH4HNO3，DTT，LTQXL 离子阱质谱仪、反向毛细管色谱分析柱，TOMM40单抗，GAPDH多抗，PMSF，BCA蛋白质定量试剂盒，碘代乙酰胺，DNA酶，RNA酶。

1.3 方法

1.3.1样品总蛋白的提取及测定 将组织样本从-80℃冰箱取出，充分研磨后加入裂解液冰上裂解30 min。加入适量DNA酶和RNA酶去除组织中残留DNA和RNA，12 000 rpm(4℃)离心10 min，即得到总蛋白。蛋白浓度测定用BCA蛋白定量试剂盒，按说明书要求，将96孔板加好，测定其在562 nm处的吸光度，根据所得数据绘制蛋白质浓度标准曲线。

1.3.2蛋白质多肽混合物的制备 室温下自然融化样品，把各样品终浓度调至20 mmol/L，此过程可用适当体积及浓度的NH4HNO3和DTT帮助稀释，56℃，避光，充分反应1 h。冷却至25℃左右后后再调整终浓度为50 mmol/L,此过程需补充一定量的1 mol/L的IAM，避光，充分反应半小时。加入适量胰酶，保证蛋白和胰酶的比例为50∶1，在37℃水浴箱中培养过夜，把得到的蛋白质多肽混合物分装并保存在-80℃冰箱里，以备后续实验使用。

1.3.3二维色谱质谱联用技术分析 将得到的蛋白多肽混合物用0.1%的FA溶解，每组样品分别取50 μg用于上样，通过强离子交换柱和反向柱洗脱分离蛋白多肽样品，用LTQXL离子阱质谱仪分析，获取LC-MS图谱。

1.3.4免疫印迹试验 用免疫印迹实验对结直肠癌组织的TOMM40蛋白表达量进行检验，验证LC-MS的分析结果。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 二维色谱与质谱联用技术分析结果

本实验癌组织及癌旁组织中同一蛋白的丰度通过图谱数来衡量，差异蛋白的满足条件为两个样品中蛋白图谱数比值 ≥1且蛋白图谱数差值 ≥72 。基于以上标准，本研究检测到Ca199、Ca153、FGB、POSTN、MUC2等21个上调蛋白，MYL9、CNN1、CKB、HSPB1、FLNA等11个下调蛋白。TOMM40为其中一个上调蛋白，质谱图结果见图1。

2.2 免疫印迹试验结果

对16对组织的TOMM40表达量检测后结果如图2所示。TOMM40在癌组织中的表达量明显增高(P<0.05)。

3 讨论

近年来，结直肠癌因早期诊断率低和治疗效果差已成为人们关注的问题[3]。其发病率在全球范围内急剧上升，尤其在50岁以下的人群中，因此需要新的诊断和治疗选择[4]。

图1 TOMM40 质谱图结果

图2 TOMM40 免疫印迹结果

线粒体是必不可少的细胞器，通过调节细胞和组织之间的通信来影响生物体的生理功能，因此线粒体功能障碍已成为包括衰老、癌症和代谢紊乱等疾病的关键影响因素[5]。线粒体由两个独立的膜组成：外膜包围可溶性膜间隙，内膜包围蛋白质密集的基质空间[6]。TOMM40又叫线粒体外膜转位酶40，对于蛋白质进入线粒体至关重要，与TOM20、TOM22共同组成线粒体外膜蛋白Tom复合体[7]。TOMM40位于TOM复合体的中心，通道由TOM40的β-桶状核心组成，并由其他亚基起稳定作用[8]。TOMM40复合体核心的直径至少能容得下两个多肽的环状结构。在动物和真菌中，TOMM40复合体的起始受体亚基包括TOM20和TOM70，TOM20在N端具有一个跨膜组分定位于外膜，C端受体区域朝向胞质溶胶一侧。Gottschalk等人发现TOMM40与迟发型阿尔茨海默病的风险和发病年龄相关，并且是迄今为止遗传研究中确定的唯一可能导致迟发型阿尔茨海默病相关线粒体功能障碍的核编码基因[9]。也有文献研究表明TOMM40与癌细胞中的线粒体密切相关，并调节ATP的产生和癌细胞的生长[10-11]。Yang研究发现TOMM40在卵巢癌细胞中的表达高于正常卵巢上皮细胞，TOMM40基因敲除降低了卵巢癌细胞系的增殖，并降低了肿瘤负担，且高表达TOMM40的上皮性卵巢癌患者的预后比低表达TOMM40的患者更差[12]。郑永昌[13]通过免疫印迹、RT-PCR、免疫组化实验表明，TOMM40在胰腺癌组织及细胞中都有高表达趋势，TOMM40是胰腺癌新的候选免疫原性膜抗原，有望用于胰腺癌的早期诊断。

本实验通过LC-MS和免疫印迹两种技术对结直肠癌及癌旁组织进行了分析和验证，确定TOMM40在结直肠癌组织中高表达，这对解决当前结直肠癌筛查和诊断的局限性提供了一个新的潜在策略，但TOMM40在结直肠癌里升高的机制还不清楚，需要下一步实验探究发掘。