华正罡，陈曦，于浩洋，冯静

（辽宁省疾病预防控制中心，辽宁省空气雾霾与人群健康监测重点实验室，沈阳 110005）

百草枯和敌草快均为带有双电荷的季铵盐类除草剂，二者常配伍使用，广泛用于控制农作物和水生杂草，在灭生型除草剂中其产量分别位居世界第二和第三。百草枯对人类的毒性极大，主要作用于肺部，会造成肺细胞的纤维化，使气体交换严重受损，最终导致中毒者血液和组织缺氧而死亡［1-5］。百草枯因其毒性高、临床无特效解毒剂已于2016 年7 月被禁止在国内销售和使用［6］，此后敌草快的销量逐渐上升，但敌草快的生产成本较百草枯高，有部分生产者为了降低成本，牟取暴利，将百草枯改名为“敌草快”或将百草枯掺入敌草快中出售。敌草快属于中等毒性除草剂，尽管其毒性较百草枯低，但毒理作用与百草枯相似，可导致中毒者死亡［7-9］。目前对于百草枯和敌草快中毒病人均无特效治疗药，因此对尿液中百草枯和敌草快的准确测定，可以为临床早期诊断提供有价值的数据信息。目前检测百草枯和敌草快的方法主要有紫外分光光度法［10］、液相色谱法［11-12］、高效液相色谱-串联质谱法［13-15］，其中，紫外分光光度法灵敏度低，不适用于生物样品的微量检测；百草枯和敌草快是季铵盐类强极性化合物，易溶于水，不易溶于有机溶剂，很难在普通C18或其它反相液相色谱柱上保留。离子对试剂可用于提高反相保留时间，但如果用串联质谱仪进行检测与定量，离子对试剂会产生显著的离子抑制作用，降低质谱检测灵敏度，同时增加质谱系统的污染。

亲水作用液相色谱（HILIC），也被称为“反反相”色谱。该色谱无需离子对试剂［16］，能够显著提高离子化效率，对强极性化合物的测定具有明显优势。考虑到生物样品基质复杂，易引起基质干扰，笔者采用弱阳离子交换固相萃取柱对尿液进行净化及浓缩，以降低基质干扰，在此基础上建立了亲水色谱-串联质谱法同时、快速测定尿液中百草枯和敌草快的方法。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱-串联质谱仪：Acquity Xevo TQ 型，美国沃特世公司。

高速冷冻离心机：Thermo ST16R 型，美国赛默飞世尔科技公司。

漩涡混合器：Vortex-genie2 型，美国Scientific industries 公司。

分析天平：BS 110S 型，感量为0.1 mg，德国赛多利斯公司。

百草枯标准物质：批号为9-KMT-123-3，纯度（质量分数）为98%，加拿大Toronto Research Chemicals（TRC）。

敌草快标准物质：批号为9-KMT-123-3，纯度（质量分数）为98%，上海麦克林生化科技有限公司。

待测尿液样品：中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所。

空白尿液样品：中国疾病预防控制中心职业卫生与中毒控制所。

乙腈、甲醇：均为色谱纯，美国赛默飞世尔科技公司。

甲酸铵、甲酸：均为优级纯，北京化工厂。

磷酸二氢钾：优级纯，国药化学试剂有限公司。实验用水为超纯水。

1.2 溶液配制

磷酸盐缓冲液：称取磷酸二氢钾6.8 g，加入500 mL 水溶解，用0.1 mol/L 氢氧化钠溶液调节pH值至6.8，加水稀释至1 000 mL。

百草枯、敌草快标准储备液：质量浓度均为1.0 mg/mL，分别称取百草枯、敌草快标准物质各（10±0.1）mg 于10 mL 容量瓶中，加入超纯水溶解并定容至标线，混匀，于-20 ℃保存。

百草枯、敌草快标准中间液：质量浓度均为100 μg/mL，分别准确吸取百草枯、敌草快标准储备液各1.0 mL 于10 mL 容量瓶中，以水稀释至标线，混匀，于-20 ℃保存。

百草枯、敌草快基质混合标准工作溶液：分别吸取百草枯标准中间液0.1 mL、敌草快标准中间液0.05 mL，置于同一只10 mL 容量瓶中，以空白基质提取液定容至标线，混匀，配制成百草枯的质量浓度为1.0 μg/mL、敌草快的质量浓度为0.5 μg/mL 的混合标准工作溶液，于-20 ℃保存，现用现配。

百草枯、敌草快基质系列混合标准工作溶液：依次准确吸取百草枯、敌草快基质混合标准工作溶液0.01、0.02、0.2、0.4、1.0、1.5 mL，分别置于6 只10 mL 容量瓶中，以空白基质提取液稀释至标线，混匀，配制成百草枯的质量浓度分别为1.0、2.0、20、40、100、150 ng/mL，敌草快的质量浓度分别为0.5、1.0、10、20、50、75 ng/mL 的基质系列混合标准工作溶液。

1.3 样品处理

准确移取0.5 mL 尿液样品，用磷酸盐缓冲液稀释定容至10 mL，涡旋混匀10 s，过预先经3 mL 甲醇和3 mL 水活化与平衡的弱阳离子交换固相萃取柱（WCX），待快流干时依次用6 mL 水和6 mL 甲醇淋洗，弃去所有淋洗液，然后用5 mL 2%甲酸乙腈溶液洗脱，收集洗脱液，于40 ℃下氮吹至近干，加入1 mL 乙腈-水（体积比为1∶1）溶液溶解残渣，经0.22 μm 疏水性聚四氟乙烯滤膜（PTFE）过滤，待测。

1.4 仪器工作条件

1.4.1 色谱

色谱柱：Waters HILIC柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国沃特世公司）；柱温：30 ℃；样品室温度：4 ℃；流动相：A 相为乙腈，B 相为200 mmol/L 甲酸铵水溶液（pH=3.7），流量为0.5 mL/min；洗脱方式：梯度洗脱；洗脱程序：0～1 min 时A 相体积分数为90%，1～3 min 时A 相体积分数由90%逐渐下降至30%，3～3.5 min 时A 相体积分数由30%逐渐下降至10%，3.5～4.0 min 时A 相体积分数由10%逐渐上升至90%，保持2 min；进样体积：10 μL。

1.4.2 串联质谱

离子源：电喷雾离子源，正离子扫描模式；毛细管电压：2.34 kV；离子源温度：150 ℃；锥孔反吹气：氮气，纯度（体积分数）大于99.999%，流量为50 L/h；脱溶剂气：氮气，温度为350 ℃，流量为650 L/h；检测方式：多反应监测（MRM）模式。百草枯、敌草快质谱参数及保留时间见表1 所示。

表1 百草枯、敌草快的质谱参数及保留时间

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

配制质量浓度均为1.0 μg/mL 的百草枯、敌草快标准溶液，过0.22 μm 滤膜，在ESI+模式下，采用全扫描模式分别进样测定，百草枯和敌草快母离子全扫描质谱图如图1 所示。由图1 可以看出，百草枯和敌草快的双电荷联吡啶离子结构特征显示了其复杂的质谱行为，百草枯能同时监测到分子离子M2+（m/z92.94）和M+（m/z186.25）及去氢分子离子［M2+-H+］+（m/z185.17）3 种类型的准分子离子；敌草快能同时监测到分子离子M2+（m/z92.87）和M+（m/z183.97）及去氢分子离子［M2+-H+］+（m/z183.07）3 种类型的准分子离子，与文献［6］报道一致。再分别以上述3 种离子作为母离子，进行碰撞解离，并对其子离子进行全扫描分析，得到目标化合物的碎片离子信息，如图2 所示。由图2 可以看出，百草枯去甲基碎片［M2+-CH3+］+（m/z171.07）和敌草快先去氢再去乙基后的碎片（m/z157.11）信号较强，可作为定量离子。然后对毛细管电压、锥孔电压、碰撞能量等参数进行优化，使得待测化合物离子对信号达到最高，并以信号响应次高的离子对作为定性离子，优化结果见表1。

图1 百草枯和敌草快母离子全扫描质谱图

图2 百草枯和敌草快子离子全扫描质谱图

2.2 色谱条件优化

百草枯和敌草快均属于季铵盐化合物，极性大，反相色谱柱难以保留，文献［17］采用向流动相中加入离子对试剂以增加其保留行为，但离子对试剂会抑制质谱信号，降低仪器检测灵敏度，同时还会对质谱系统造成污染。亲水色谱（HILIC）采用强极性固定相来改善强极性物质保留行为的色谱技术，结合高比例的有机相和低比例水相组成流动相体系，可实现百草枯和敌草快的保留和分离，因此选择Waters HILIC 色谱柱为分离柱，乙腈-水为流动相。

百草枯和敌草快极易被玻璃和不锈钢等材料吸附，在样品制备和检测过程中应完全避免使用玻璃和不锈钢器皿，但在检测过程中仪器的管路及色谱柱接口的不锈钢材料对待测化合物造成的吸附无法避免，而且硅胶基色谱柱上残留的硅羟基对带正电荷的百草枯和敌草快会有二级吸附作用，综合表现的结果为色谱峰展宽并且严重拖尾，如图3（a）所示。为了减少测定过程中对待测化合物的吸附，提高测定结果的准确度，一是向流动相中加入一定浓度的甲酸铵缓冲液以竞争性拮抗硅羟基结合位点对待测物的吸附，改善色谱峰拖尾；二是增加流动相流量，以进一步加强洗脱能力。分别考察了在水相中加入浓度为50、100、150、200 mmol/L 的甲酸铵缓冲液和流量分别为0.3、0.4、0.5 mL/min 时的色谱行为，结果表明，以200 mmol/L 甲酸铵溶液作为水相，流量为0.5 mL/min 时，色谱峰的对称因子为0.95～1.05，满足系统适应性试验对色谱峰对称性的要求，如图3（b）所示。

图3 不同浓度甲酸铵作为水相时百草枯和敌草快的色谱图

2.3 基质效应

在1.4 仪器工作条件下，测定百草枯、敌草快基质混合标准工作溶液，记录百草枯和敌草快的色谱峰面积（A），然后测定相同浓度水平的溶剂标准溶液中百草枯和敌草快的色谱峰面积（B），各平行测定5 次。根据公式R=A/B×100%计算基质效应。计算得百草枯的基质效应为2.8%，敌草快的基质效应为4.9%，表明尿样基质对百草枯和敌草快均有显著的基质抑制作用（R小于85%认为存在基质抑制效应［18］）。基于百草枯和敌草快的季铵盐阳离子特性，选择混合型聚合物反相吸附和弱阳离子交换机理的固相萃取柱对样品进行净化处理。平行称取6份空白尿液样品，分别加入适量的百草枯、敌草快混合标准工作溶液，按1.3 样品处理方法处理，在1.4仪器工作条件下进样测定，结果显示敌草枯和百草枯的基质效应分别为95.3%和98.4%，表明样品经净化后基质不干扰待测物的测定。

2.4 线性方程与检出限

在1.4 仪器工作条件下，分别对百草枯、敌草快基质系列混合标准工作溶液进行测定，以待测化合物的质量浓度（X）为横坐标、以定量离子对的色谱峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，计算线性方程和相关系数。以3 倍信噪比对应的质量浓度作为方法检出限。百草枯和敌草快的质量浓度线性范围、线性方程、相关系数及检出限见表2。

表2 质量浓度线性范围、线性方程、相关系数及检出限

2.5 加标回收与精密度试验

准确称取6 份尿液空白样品各0.5 mL，分别加入百草枯、敌草快混合标准工作溶液各100 μL，按1.3 样品处理方法处理，在1.4 仪器工作条件下进样测定，结果见表3。由表3 可知，百草枯和敌草快的平均回收率分别为100.9%，100.8%，测定结果的相对标准偏差分别为2.6%、1.6%，表明该方法的精密度和准确度良好。

表3 加标回收与精密度试验结果

3 结语

建立了亲水色谱-串联质谱法快速测定尿液中百草枯和敌草快的方法。该方法具有较好的精密度、准确度和灵敏度，适合尿液中百草枯和敌草快的快速检测。