张晓枫，姚 瑶，宋孝雄，邢婉青，喻 斌

(南京中医药大学药学院,江苏省中药药效与安全性评价重点实验室，江苏 南京 210023)

神经干细胞(neural stem cells,NSCs)是存在于脑和脊髓中的未分化细胞，具备自我更新和向神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞分化的潜能[1]。1992年,Reynolds[2]从成鼠脑纹状体分离得到NSCs，而且已经发现在成年和胚胎哺乳动物脑中均有NSCs分布，此后，NSCs用于中枢神经系统退行性疾病及脑损伤修复的研究受到重视。离体细胞评价是药理学研究的重要组成部分，但至今还没有理想的可以替代原代NSCs的细胞株，因此获得稳定而高效的原代NSCs是进行后继生理和药理学研究的重要基础和保障。原代细胞培养的困难主要在于细胞的纯度、得率以及活性方面的控制，虽然已有文献对NSCs的原代分离和细胞纯化方法进行介绍[3]，但这些研究往往是对某一种既定的方法进行改良，而并没有对不同分离方法，以及不同纯化方法进行全面的评估。此外各文献报道的培养条件差异很大[4-5]，这也必然导致其他研究者在条件选择中的困惑。鉴于此，本次实验对三种分离方法和两种纯化的方法进行比较，其结果可为其他学者的体外NSCs培养体系构建提供技术支持。

1 材料

1.1 实验动物出生24 h内的ICR/Gpt小鼠，雌雄不限，由江苏省集萃药康生物科技有限公司提供，许可证号：SCXK(苏)2018-0008。

1.2 试剂和仪器Neurobasal培养基(批号：21177670)、B-27 Supplements(批号：2175187)、GlutaMAX(批号：2164675)、双抗(批号：2145460)、胰酶(批号：2120917)均购于Gibco公司；碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)(批号：0315395-1)、表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)(批号：0819179)均购于PeproTech公司；小鼠巢蛋白(Nestin)抗体(批号：31016A32)、小鼠Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG(批号：2018207)均购于Invitrogen公司；多聚赖氨酸(Poly-L-lysine solution,PLL)(批号：RNBJ2237)、层粘连蛋白(Laminin)(批号：049M4183V)均购于Sigma公司；肝素钠(批号：722I024)、胰蛋白酶抑制剂(批号：1028D062)、脱氧核糖核酸酶(DNaseⅠ)(批号：623X034)、中性蛋白酶(Dispase)(批号：325U012)、木瓜蛋白酶(Papain)(批号：628L021)、D-无水葡萄糖(批号：526J022)、台盼蓝(批号：722I024)、曲拉通(Trition-100)(批号：829I0210)、细胞核染色液(DAPI)(批号：20200715)购于索莱宝公司。

超净台(SW-CJ-1F，苏州市净化公司)；CO2恒温培养箱(MCO-20AIC，日本SANYO公司)；荧光倒置显微镜(Ti-S，日本NIKON公司)；解剖显微镜(SZ51型日本OLYMPUS公司)；细胞计数仪(美国Countstar公司)；ImageQuant LAS4000mini成像系统(美国GE公司)。

2 方法

2.1 NSCs不同分离方法比较研究

2.1.1NSCs的分离 将新生24 h乳鼠分为3组，分别为机械吹打组(mechanical pipetting)、胰酶消化组(trypsin digestion)和PDD混合酶消化组[5](木瓜蛋白酶2.5 kU·L-1，中性蛋白酶1 kU·L-1，DNaseⅠ 250 kU·L-1，Papain-Dispase-DNase enzyme digestion，PDD)。各组乳鼠脱颈处死，75%乙醇中消毒5 min，剪开颅骨取出大脑，置于冷磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)中，在解剖显微镜下去除脑膜、小脑、嗅球等，用预冷的PBS冲洗组织，吸去多余的PBS，随后按照组别进行不同的分离操作。

(1)机械吹打组：脑组织用手术刀切碎至1 mm3，转移到含有37 ℃预热的基础培养基中，用巴氏滴管吹打至无肉眼可见组织，过400目细胞筛得单细胞悬液，1 000 rpm，离心5 min，弃上清，加入1 mL完全培养基重悬细胞；(2)胰酶消化组：相同体积的碎脑组织转移至预热的0.05%的胰酶[6]中，37 ℃消化7 min，加入0.125 g·L-1胰蛋白酶抑制剂(含0.01 g·L-1DNaseⅠ)混匀，离心，弃上清，加入5 mL完全培养基过筛，离心，加入1 mL完全培养基重悬细胞；(3)PDD混合酶消化组：相同体积的碎脑组织转移至37 ℃预热的PDD混合酶中，37 ℃消化20 min，轻轻吹打细胞后再次37 ℃消化20 min，用巴氏滴管吹打细胞，离心，弃上清，用混合缓冲液(1× HBSS，30 mmol·L-1葡萄糖，2 mmol·L-1HEPES缓冲液，26 mmol·L-1NaHCO3)重悬细胞并过筛，离心，加入1 mL完全培养基重悬细胞。

以上重悬细胞分别用台盼蓝染色，计数总细胞数及存活率。

2.1.2NSCs的培养和神经球直径的检测 采用无血清的培养基进行培养，其中Neurobasal培养基中包含2%B27、1%GlutaMAX、2 mg·L-1肝素、20 μg·L-1EGF、20 μg·L-1bFGF和1%青链霉素。将分离出的单细胞密度调整为1.0×109·L-1，于25 cm2培养瓶内原代培养5 d，每2 d半量换液，并于1、3、5 d检测神经球直径。

2.1.3NSCs的活性和增殖检测 在96孔板内把三种不同分离方法总细胞数以2×108·L-1密度接种，每组5个复孔，分别在1、5 d向细胞悬液中加入10%CCK-8试剂，混匀，继续培养4 h，用酶标仪测定450 nm处的吸光度。

2.1.4Western blot检测Nestin蛋白含量 将培养瓶内培养5 d的细胞取出，RAPI裂解液提取细胞总蛋白后进行蛋白质定量(BCA法)，等量蛋白进行SDS-PAGE电泳、转膜和封闭，4 ℃孵育一抗过夜，TBST洗膜后室温孵育二抗，再次洗膜3次，显色成像，利用ImageJ进行灰度和面积计算。以NSCs标志物Nestin和Actin的比值代表Nestin相对表达量，以间接反映NSCs的纯度。

2.2 NSCs不同纯化方法比较研究为了让纯化方法的结果齐同可比，我们选择机械吹打法分离原代NSCs，然后分别采用过筛法和差速离心法纯化NSCs。

2.2.1过筛法 原代神经球直径达100 μm左右，通过200目细胞筛去除杂细胞，颠倒筛子，基础培养基将神经球冲洗下来，离心，弃上清，0.05%胰酶消化，以5×107·L-1密度接种到包被的24孔板的爬片内，待细胞贴壁成球后，荧光鉴定杂细胞数。

2.2.2差速离心法 每2～3 d换液时，分别使用1 000、800、500 rpm离心，获得神经球，去除杂细胞，最后同样使用0.05%胰酶消化成单细胞悬液，以5×107·L-1密度接种，待细胞贴壁成球后，荧光鉴定杂细胞数。

2.2.3Nestin/DAPI双染法检测NSCs纯度 提前用PLL/Laminin包被24孔板内的盖玻片，将单细胞以5×107·L-1的密度接种，培养5 d后，PBS洗去残留培养基，4%多聚甲醛固定30 min，PBS清洗后加0.25%Trition-100室温下透膜15 min，清洗，用1%牛血清白蛋白室温下封闭1 h，吸去封闭液，加入一抗(1 ∶100兔抗鼠Nestin抗体)4 ℃孵育过夜，PBS清洗，加入二抗(1 ∶500山羊抗兔488抗体)，37 ℃避光孵育1 h，PBS清洗，滴加DAPI避光染色10 min，PBS清洗，滴加抗荧光淬灭液封片，在荧光显微镜下观察并随机选取5个视野拍照，以Nestin阳性细胞数与DAPI阳性细胞数的比值反应NSCs的纯度。

3 结果

3.1 不同分离方法的原代NSCs生长情况比较原代培养5 d，分别观察1、3和5 d神经球生长情况(Fig 1A)并测量神经球的直径(Fig 1B)，提示PDD混合酶消化组得到的NSCs成球速度较机械吹打组和胰酶消化组更快(P<0.01)。

Fig 1 Comparison of three separation methods in neurosphere’s growth situation on day 1,day 3 and day 5 n=3)

3.2 不同分离方法的原代NSCs活性和增殖情况比较3种分离方法都能得到大量的NSCs，台盼蓝染色计数后，与机械吹打组相比，胰酶消化组(P<0.05)和PDD混合酶消化组得到细胞的存活率更高(P<0.01)(Tab 1)，CCK-8活性检测结果显示(Fig 2)，机械吹打组和胰酶消化组的吸光度低于PDD混合酶消化组，且差异具有显著性(P<0.01)；Fig 3结果显示，d 5，机械吹打组和胰酶消化组的吸光度明显低于PDD混合酶消化组，差异具有显著性(P<0.01)，提示PDD混合酶消化所得细胞活性更高，增殖更快。

Tab 1 Total cell count and survival rate of three primary

3.3 不同分离方法的原代NSCs的Western Blot检测结果如Fig 4所示，d 5，Western blot结果显示，胰酶消化法和PDD酶消化法Nestin蛋白含量表达高于机械吹打法(P<0.05)。

Fig 2 Activity of primary cells on day 1 n=3)

Fig 3 Activity of primary cells on day 5 n=3)

Fig 4 The protein expression of Nestin and Actin by each separation method on day 5 n=3)

3.4 不同分离方法的原代NSCs纯度比较结果对原代培养5 d的细胞进行Nestin/DAPI双染，观察到Alexa Fluor 488标记Nestin发绿光，有细胞染色为阳性，确定为NSCs，只标记DAPI发蓝色荧光的细胞为杂细胞，其中3种分离方法的杂细胞数差异没有显著性(Fig 5A,B)。

Fig 5 Immunofluorescence staining of nestin in separating and purifing primary n=3)

3.5 两种纯化方法的NSCs荧光鉴定结果对两种纯化方法得到的NSCs进行Nestin免疫荧光染色，如Fig 5C,D所示，两种纯化方法的Nestin阳性率均高于原代NSCs(P<0.05)。

4 讨论

目前，分离NSCs常用的方法包括机械吹打法、胰酶消化法，但前者的分离方法得到的细胞存活率低，后者酶的浓度、消化时间难控制；纯化方法包括连续传代法、有限稀释法[5]、免疫磁珠法[12]等，但这些纯化方法周期长、价格昂贵。本文在现有的分离和纯化方法上进行比较，得到原代NSCs存活率更高的分离方法和操作简便且纯度高的纯化方法。

3种分离方法中，机械吹打法虽然获得的细胞数多，但细胞的存活率低、NSCs成球速度慢，在实验操作中吹打至肉眼见不到组织即可，不可过度吹打；胰酶消化法中使用0.05%的胰酶，对乳鼠疏松的脑组织损伤更小；PDD混合酶[7]消化作用温和，对NSCs的损伤较其他两种方法小，且得到的NSCs成球速度快，且这次研究对该方法进行了优化，现有的该方法用于成年小鼠DG区域NSCs的分离，步骤繁琐耗时，因此，优化其步骤，缩短分离时间可以最大限度保证细胞活性。此次研究采用过筛法和差速离心法纯化NSCs，两种纯化方法Nestin鉴定证实两种方法均能有效纯化NSCs，为了减少过筛法中细胞的损失，多次使用培养基吹打收集筛网上的神经球；换液时可以根据神经球的大小改变离心速度，从而差速离心出神经球，去除单细胞或组织碎片，纯化NSCs。Nestin是神经干细胞特异性标志物，文中主要使用免疫荧光双染法鉴定神经干细胞，具有特异性强、速度快的优点，较传统的DAB显色法[13]得到的图片更清晰。

目前，大量实验和临床研究发现,NSCs移植可以分化为神经元并逐渐替代变性神经元，保护神经元免受兴奋性毒性损伤，还可以通过产生神经营养因子，改善疾病症状，从而治疗各种神经退行性疾病和神经损伤性疾病，如帕金森病[7-8]、阿尔茨海默病[9]、亨廷顿病[10]、中风[11]等。因此，比较神经干细胞在体外分离、维持、扩增的最佳培养方法，能够更详细地探索其性质以及调节它们的机制，把基础研究应用到临床。