孙阳，李松哲，孙悦，姜德友

(黑龙江中医药大学基础医学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

肝细胞癌(HCC)是癌症疾病中致死率极高的癌种，现代研究普遍认为慢性肝炎或肝硬化的发展可导致肝癌的形成[1-2]。由于肝实质上没有痛觉神经的分布，当触及肝被膜引起疼痛时可能已经达到中晚期，且肝脏承担净化血液的作用，极易受到其他脏器癌症的侵袭，以上原因直接导致手术治疗范围有限，往往只局限于没有血管侵犯或结节或远处转移的孤立性肿瘤，而且，即使在术后，生存期也并不理想[3-4]。中医药的发展历史悠久，无论单味药还是组方在抗肿瘤实验与临床中皆能看到较好的疗效。

射干是鸢尾科植物，干燥根茎入药，具有清热解毒的功效，为苦寒之性[5]，苦味自有坚阴之功，可清泄邪热而护阴津[6]，肝为刚脏，受癌疾所累易化风化火，故初期常见昏朦、发热，与射干之品性相配。在现代实验分析中，也有数据表明射干在诸如肺癌[7]、卵巢癌[8]、结肠癌[9]和前列腺癌[10]中具有明显的抑制作用，其组方鳖甲煎丸也被证明对肝癌的抑制明显[11]。但射干抗肝癌的物质药效基础和靶点蛋白通路尚不明确，故本文基于此，通过搜集射干有效活性成分与肝癌的核心靶点进行分子对接，希望为之后的实验研究提供方向。分子对接是近年来药物靶点构效关系和药物分子设计研究的一种有效手段，将已知的配体小分子放到受体活性位点，通过变化配体小分子构象，采取化学环境、几何和能量互补的原则，评价配体小分子与受体互相作用强弱和结合能力，寻找配体小分子与受体蛋白的最佳构象并计算结合自由能[12]。

1 材料与方法

1.1 射干有效成分的搜集

通过TCMSP[13](Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database andAnalysis Platform)数据库搜寻射干的活性成分，并根据口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30% 和类药性(drug-likeness，DL)≥0.18这2个ADME属性值进行活性成分筛选，共获得活性小分子17个，再通过文献检索，搜寻被过滤掉的重要小分子或未被收录的小分子，最终得到鸢尾黄素和次野鸢尾黄素2个，共计19个小分子，分子结构及编号见图1。

图1 射干中的生物碱结构及编号

1.2 肝癌关键靶点的搜集

以“liver cancer”为肝癌的关键词，挖掘GeneCards数据库(https://www.genecards.org)中治疗肝癌的潜在靶点，取前10个相关性最高的靶点(2020年12月下载)，去除无明确晶体结构蛋白、无明确临床用药或批准的实验用药蛋白，最终得到靶基因受体7个。分别是BRCA1、TP53、MSH2、PTEN、MLH1、EGFR和TNF，再通过RCSB PDB数据库(http://www.rcsb.org/) 下载这些靶基因对应的蛋白晶体结构，PDB编号及靶点肝癌相关性见表1。

表1 阳性对照物PDB编号及肝癌相关性

1.3 阳性对照化合物的搜集

通过GeneCards数据库搜索作用靶基因蛋白的小分子药物，以得到正式认可的药物为优先考虑，若无正式认可的药物则采用已批准的临床实验性或研究性药物，再与Drug Bank数据库进行比对确认，之后通过Zinc15数据库[14]检索阳性对照化合物名称，下载mol2文件，分子结构及对应靶基因信息见图2。

图2 阳性对照物小分子及对应靶基因

1.4 分子对接软件及前期准备

分子对接软件采用autodockTools 1.5.6中的vina模块[15]，其中根据vina报道，经vina处理的分子-靶点对接结果中，RMSD<2的比例高达78%，RMSD<2被认为对接方案可行，故通过vina的分子对接预测可以被认为可行性、准确性较高。将射干、阳性对照组小分子和靶点蛋白通过去除水分子，加氢进行预处理，采用盲性对接法实行预测，其余参数均采用默认值，得到预测结果，结果以生成氢键的数值为优先，以阳性对照物所得的结合自由能为基准，低于阳性对照物且生成氢键的小分子的自由能数值加粗表示，若小分子已经低于对照组的结合自由能，却还未生成氢键模型，则收录最小值，在数值后用“*”标出。

2 结果

2.1 阳性对照物与对应靶基因蛋白分子对接

通过Vina对接得出结合自由能，所得结果皆以生成氢键为基准，单位为kcal·mol-1，结合自由能数值见表2。

表2 阳性对照物与对应靶基因蛋白对接结果

2.2 综合对接结果

将图1与表1所示的小分子与蛋白质一一进行对接，共得出133组对接结果，以阳性对照物分子对接数值为基准，结合自由能单位为kcal·mol-1，候选化合物与各靶基因蛋白作用情况见表3。

依据表3所得数据，可视化每组靶基因蛋白中与小分子的最优对接结果，并利用VMD软件可视化原配体与配体对接构象叠合图，见图3。

表3 候选化合物与各靶基因蛋白作用情况

图3 潜力小分子与靶基因蛋白对接构象及与原配体叠合图

3 讨论

通过分析以上对接数据，与肝癌极为密切的7个靶基因蛋白中，射干有效活性成分对TP53、MSH2、PTEN、MLH1和TNF皆表现出优于阳性对照物的结合能力，在BRCA1与EGFR中的结合自由能虽未低于阳性对照物，但皆小于-1.2 kcal·mol-1，而对接结合自由能小于1.2 kcal·mol-1通常被认为对接良好，所以可以预测出射干对肝癌的主要靶基因具有良好的作用效果。其中1号和6号小分子表现出较为突出的、普遍性的抗肝癌作用，分别是异牡荆素(Isovitexin)和鸢尾醛型新三萜(Anhydrobelachinal)。

在近期的实验中，发现Isovitexin可以通过基因调节抑制肝细胞癌(HCC)[16]，下调锰超氧化物歧化酶(MnSOD)和叉头盆蛋白质M1(FoxM1)而降低HCC中干样细胞(HCSLC)的干性而起到抗癌作用，并在肺癌研究中也发现了类似的情况，还发现可以抑制EMT表型及MMP2的表达[17-18]。CHEN和LIU等人也发现，Isovitexin可以增强体内TNF-α的产生或抑制肾脏内TNF-α和IL-6的产生而起到保护肾脏的功能，既可以有效防止因顺铂导致的肾损伤，又可以增强顺铂的抗肿瘤活性[19-20]。Anhydrobelachinal目前的抗肿瘤证据较少，主要是发现Anhydrobelachinal的半抑制浓度(IC50)在0.1～5.3 microg/mL时对人类肿瘤细胞系A2780和K562具有一定的细胞毒性[21]，这被认为具有抗肿瘤作用[22]，其具体机理还有待进一步探索。

还需注意的是，基因突变是导致癌症产生的重要因素，而在本次预测模型中，MSH2与MLH1是参与DNA错配修复途径的重要组成部分，在多项研究中皆发现MSH2与MLH1的突变或丢失导致了一定比例的癌症，因基因错配导致不匹配识别使下游基因异常表达[23-25]，且MLH1/MSH2基因的低甲基化也被认为在癌症的化学耐受性中尤为重要[26]。而射干中的大量小分子在与MSH2和MLH1的结合中表现出良好的结合能力，低于阳性对照组且生成氢键的比例分别为68.4%和89.4%，所以也可初步推测射干可以通过DNA错配修复途径影响肝癌的发生发展。

4 结论

本实验对射干抗肿瘤进行了虚拟筛选，选取了7个与肝癌相关性极为密切的靶基因，从现有的56个生物碱中筛选出19个潜在活性成分，1号和6号小分子通过筛选模拟被认为抗肝癌潜力突出，且在实验中已经被证明具有一定抗癌活性，与本实验结论相符。其中，多数活性生物碱与MSH2和MLH1具有良好的结合能力，所以可以推测，射干可能主要通过DNA错配修复途径影响肝癌的发展，或在肝癌的化学药物治疗中，对提高抗药性具有一定积极作用。