石兴红，罗金梅，杨淡梅，符秋美，邱颖姮，邬晓鸥，王晓炜

（深圳市药品检验研究院，国家药品监督管理局化妆品监测评价重点实验室，广东 深圳 518000）

牙膏是由摩擦剂、保湿剂、增稠剂、发泡剂、芳香剂、水和其他添加剂为主要原料混合组成的膏状物质［1］，具有清洁口腔、防龋、抑牙菌斑、抗牙本质敏感、减轻牙龈问题等功能，是人们日常生活的必需品。牙膏中的着色剂主要起改善产品感观、提升使用者体验的作用，尤其是儿童牙膏，鲜艳的颜色更容易吸引孩子们的注意。由于儿童刷牙过程中可能存在吞咽现象，其安全风险因素尤需高度关注。

着色剂按来源可分为无机着色剂、天然着色剂和合成着色剂三大类，牙膏中常见的着色剂以合成着色剂为主，如食品红12、食品黄4、食品蓝2等［2］。合成着色剂具有色调多、着色力强、稳定性好、价格低廉等特点，在食品加工业和化妆品中被广泛应用；但合成着色剂主要以苯、甲苯、萘等芳烃类化工产品为原料，经过磺化、卤化、偶氮化等一系列有机反应化合而成，长期或过量使用可能引起瘙痒、疼痛等不良反应，严重者甚至影响肝肾功能、产生遗传毒性和致癌性等危害人类健康［3－4］，因此，我国《化妆品技术规范》（2015年版）（以下简称《规范》）对合成着色剂的使用范围及使用量都有明确规定［5］。我国《化妆品监督管理条例》第77条指出：“牙膏参照本条例有关普通化妆品的规定进行管理”［6］。目前食品、化妆品中着色剂的检测方法已有诸多文献报道［7－18］，涉及的方法包括高效液相色谱法（HPLC）、超高效液相色谱法（HPLC）和液相色谱－串联质谱法（LC－MS/MS）等，但牙膏中着色剂的检测鲜有报道。为此，本文建立了HPLC同时测定牙膏中食品黄4等19种准用合成着色剂的检测方法，该方法操作简便、快速、准确，适用于牙膏中常用合成着色剂的定性与定量分析。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Alliance 2695－2998高效液相色谱仪，带二极管阵列检测器（美国Waters公司）；XS105DU电子天平、S20酸度计（瑞士Mettler Toledo公司）；VORTEX 3 S025涡旋混合器（德国IKA公司）；BDA-1002超声波清洗器（深圳波达超声波清洗设备有限公司）；EBA21离心机（德国Hettich公司）。

19种合成着色剂标准品：食品黄4（Food Yellow 4，CI 19140）、食品红9（Food Red 4，CI 16185）、食品蓝1（Food Blue 1，CI 73015）、食品红7（Food Red 7，CI 16255）、食品黄3（Food Yellow 3，CI 15985）、酸性橙6（Acid Orange 6，CI 14270）、食品红17（Food Red 17，CI 16035）、食品红1（Food Red 1，CI 14700）、食品绿3（Food Green 3，CI 42053）、酸性红87（Acid Red 87，CI 45380）、食品蓝2（Food Blue 2，CI 42090）、酸性黄73（Acid Yellow 73，CI 45350）、食品红14（Food Red 14，CI 45430）、酸性橙7（Acid Orange 7，CI 15510）、酸性红92（Acid Red 92，CI 45410）、食品蓝5（Food Blue 5，CI 42051）购自德国Dr.Ehrenstorfer公司；食品黑2（Food Black 2，CI 27755）购自美国IL公司；酸性黄1（Acid Yellow 1，CI 10316）购自日本TCI公司；食品红12（Food Red 12，CI 17200）购自日本Wako公司。

甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司），乙酸铵（HPLC级，美国Acros公司），甲酸（色谱纯，上海Macklin公司），实验用水为超纯水。25批牙膏样品均为市售品。

1.2 实验方法

1.2.1色谱条件色谱柱：Agilent eclipse XDB－C18柱（4.6 mm×150 mm，5μm）；柱温：35℃；流动相：A为20 mmol/L乙酸铵溶液（pH 6.0），B为乙腈；流速为0.7 mL/min。梯度洗脱程序：0.0～2.0 min，5%B；2.0～4.0 min，5%～13%B；4.0～9.0 min，13%～14.5%B；9.0～10.0 min，14.5%～20%B；10.0～15.0 min，20%～25%B；15.0～24.5 min，25%～35%B；24.5～25.0 min，35%～75%B；25.0～29.0 min，75%B；29.0～30.0 min，75%～5%B；30.0～40.0 min，5%B；进样量：5μL；检测波长：430、480、520、620 nm。

1.2.2标准溶液的配制标准储备溶液：分别取各着色剂标准物质适量，精密称量，分别置于10 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，得质量浓度为1 000 mg/L的单个标准储备溶液（按纯度换算），4℃保存备用。

系列标准工作溶液：分别精密吸取1 mL单个标准储备液于同一20 mL容量瓶中，用水定容至刻度，即得质量浓度为50 mg/L的混合标准溶液。吸取上述混合标准溶液适量，用10%甲醇溶液配制成各标准溶液质量浓度分别为1、5、12.5、25、35和50 mg/L的系列标准工作溶液。

1.2.3样品前处理称取样品1.0 g（精确至0.1 mg），置于10 mL具塞比色管中，加入4 mL水，在涡旋混合器上高速振荡，使样品分散；加入1.0 mL甲醇进行消泡处理，继续加入水至9 mL，涡旋混匀，超声提取10 min，冷却至室温（若仍有气泡，可滴加少量甲醇进行消泡处理），用水定容至10 mL，以10 000 r/min离心5 min，取上清液经0.45μm微孔聚四氟乙烯（PTFE）滤膜过滤，滤液待测。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1检测波长的选择采用二极管阵列检测器，在200～800 nm范围内对19种着色剂的混合标准溶液进行全扫描。结果表明，上述19种着色剂在紫外光区（254 nm左右）和可见光区均有较强吸收，在254 nm易受牙膏样品中防腐剂色谱峰的干扰，故选用各化合物的可见光区特征吸收峰作为检测波长。根据各着色剂的最大吸收波长，确定了19种着色剂的检测波长（见表1）。经验证，19种着色剂在相应的检测波长下，无干扰且响应值高，方法特异性好。不同检测波长下19种合成着色剂混合标准溶液（5 mg/L）的液相色谱图如图1所示。

图1 19种合成着色剂在不同检测波长下的液相色谱图（5 mg/L）Fig.1 HPLC chromatograms of 19 kinds of synthetic colorants at different detection wavelengths（5 mg/L）

2.1.2色谱柱的选择选择常用的十八烷基键合硅胶色谱柱进行液相分离，实验比较了Agilent zorbax SB－C18柱和Agilent eclipse XDB－C18柱对19种准用着色剂的分离效果。结果发现两根色谱柱的分离效果相当，但色谱柱填料是否封端对部分着色剂（食品红9、食品红7和食品绿3）的峰形影响较大，选用经过封端的Agilent eclipse XDB－C18柱更合适。

2.1.3流动相的选择由于19种合成着色剂的化学结构有较大差异，包括有偶氮染料、吨染料和三芳甲烷染料等，但大部分着色剂均含磺酸根强阴离子。这些化合物与固定相之间可能存在离子相互作用和非极性吸附的双重作用，要获得理想的分离效果和良好的峰形，流动相中乙酸铵浓度和pH值选择非常重要。

考察了不同乙酸铵溶液浓度（10、20、30、50 mmol/L）对19种合成着色剂色谱保留行为的影响。结果表明，在相同色谱条件下，乙酸铵溶液浓度对大多数合成着色剂的分离效果影响不大，但乙酸铵溶液浓度为20 mmol/L时，食品黄3和酸性黄1、食品绿3和酸性红87、酸性黄73及食品红14的分离效果更佳，因此实验选定乙酸铵的最佳浓度为20 mmol/L。

采用乙腈－20 mmol/L乙酸铵溶液为流动相，考察了pH值分别为4.5、5.0、5.5和6.0时，对19种合成着色剂色谱保留行为和峰形的影响。结果显示，pH 6.0时，19种化合物达到基线分离且峰形较好；随着酸度的增加，部分化合物在色谱柱上的保留增强，导致一些化合物出峰顺序改变，不仅色谱峰重叠，分离效果差，同时存在严重拖尾现象；因此，乙酸铵溶液以pH值6.0为宜。此外，考察了用甲酸和乙酸作为酸度调节剂时各化合物色谱峰的分离效果，发现采用甲酸的效果优于乙酸。

2.1.4柱温的选择温度变化可改变目标化合物在流动相和固定相间的分配系数，实验比较了柱温分别为25、30、35、40℃时对19种合成着色剂分离效果的影响。结果表明，随着柱温的升高，各化合物的保留时间相对缩短，酸性黄73的变化最为明显。当柱温达到35℃，19种着色剂的分离效果最佳。

2.2 样品前处理条件的选择和优化

19种合成着色剂的理化性质相似，易溶于水，可用水直接提取；由于牙膏中含有发泡剂（普遍使用的是月桂醇硫酸钠），直接用水提取，发泡剂影响样品分散及定容，需加入甲醇进行消泡处理。实验直接使用5%、10%、20%、25%、50%甲醇溶液提取，结果显示，当甲醇溶液浓度高于20%时，溶剂效应导致食品黄4和食品红9分解成2个色谱峰，回收率下降。为了确保样品提取完全及定容准确，样品先用水进行分散提取，再加入少量甲醇进行消泡后定容，并控制最终提取溶液中甲醇含量低于20%。

此外，还比较了不同超声提取时间（5、10、15、20 min）对阳性样品中目标化合物提取效率的影响。结果表明，超声提取时间超过10 min后提取效率不再增加，故选择10 min为最佳超声提取时间。

2.3 线性范围、检出限与定量下限

取“1.2.2”系列标准工作溶液，按优化色谱-质谱条件进行测定。以峰面积（y）为纵坐标，质量浓度（x，mg/L）为横坐标，绘制标准曲线。由表1可知，19种组分在1～50 mg/L质量浓度范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999。称取1.0 g空白样品，加入不同浓度的待测组分，按“1.2.3”处理后进样，以各待测化合物的信噪比（S/N）分别计算得出方法检出限（LOD，S/N=3）和定量下限（LOQ，S/N=10）。结果显示：19种着色剂的LOD和LOQ分别为0.3～2.6μg/g和0.9～8.6μg/g（见表1）。方法的灵敏度能满足目前的检测要求。

表1 19种合成着色剂的检测波长、线性方程、线性范围、相关系数（r）、检出限及定量下限Table 1 Detection wavelengths，linear equations，linear ranges，correlation coefficients（r），LODs and LOQs of 19 synthetic colorants

2.4 回收率与相对标准偏差

取空白样品1.0 g，加入适量混合标准溶液，使其含量分别为25μg/g和400μg/g，每个加标水平平行测定6份，按“1.2.3”所述方法进行处理并测定，计算回收率及相对标准偏差（RSD），结果见表2。19种着色剂的回收率为95.2%～103%，RSD（n=6）均小于5%，表明方法具有较好的准确度及精密度。

表2 牙膏中19种着色剂的回收率与相对标准偏差Table 2 Average recoveries and RSDs of 19 colorants spiked in toothpaste

2.5 实际样品的测定

用所建立的测定方法对市售25批牙膏进行测定，以标准品色谱图中各化合物的保留时间及紫外-可见吸收光谱图进行定性定量分析，阳性样品的色谱图见图2，检测结果见表3。数据显示：有7批样品检出食品蓝2，含量范围为1.1～17.8μg/g；有4批样品检出食品黄4，含量范围为4.8～31.1μg/g；有4批检出食品黄3，含量范围为2.6～25.5μg/g；有1批样品同时检出食品黄4、食品蓝2和食品黄3；有3批样品分别检出食品红12、食品绿3和酸性红92，含量分别为4.5、1.1、55.3μg/g；其他着色剂未检出。

图2 牙膏样品的色谱图Fig.2 Chromatograms of positive toothpaste samples

表3 实际样品的检测结果（μg/g）Table 3 Test results of real samples（μg/g）

（续表3）

3 结 论

本研究建立了HPLC测定牙膏中19种合成着色剂的检测方法，可有效排除牙膏基质干扰，并通过优化色谱条件，使19种着色剂在26 min内能得到良好的分离，在不同检测波长下测定，提高了各成分的灵敏度。结果表明，该方法简便、快速、准确，适用于牙膏中着色剂的检测；其推广应用对牙膏中准用着色剂的安全监管具有积极意义。