孙永欣，马淑慧，王庆志，任同军，都兴范，李树英

( 1.辽宁省海洋水产科学研究院，大连市海产贝类种质资源创新利用重点实验室，辽宁 大连 116023； 2.大连海洋大学 水产与生命学院，辽宁 大连 116023 )

红鳍东方鲀(Takifugurubripes)属鲀形目、鲀科、东方鲀属[1]，因其肉质鲜美、营养价值高成为目前海水养殖的重要品种之一。随着养殖规模扩大，寄生虫、细菌、病毒等引起的疾病对红鳍东方鲀养殖造成极大危害[2]。养殖过程主要通过化学药物和抗生素来预防和治疗疾病，但是过量使用化学药品和抗生素会导致病原微生物耐药性增加及环境污染等社会问题[3]。为此，科研工作者不断研发绿色环保的抗生素替代物，以作为饲料添加剂预防鱼类疾病。

柞蚕免疫活性物质是利用外源益生菌通过体外人工注射，经过一定时间培养后诱导柞蚕(Antheraeapernyi)蛹体产生的抗菌肽、溶菌酶、凝集素等多种活性多肽和蛋白类物质[4]。前期研究证实，含有柞蚕免疫活性物质的柞蚕免疫蛹粉作为饲料添加剂能显著提高仿刺参和凡纳滨对虾的质量增加率和抗病力[5-6]。笔者以红鳍东方鲀为研究对象，考察柞蚕免疫蛹粉饲料添加剂对其生长、免疫和抗病力的影响，为柞蚕免疫活性物质免疫增强剂在水产养殖中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验用鱼

红鳍东方鲀幼鱼购自大连天正实业有限公司，初始体质量为(58.52±2.07) g，鱼体体表完整无伤。

1.2 方法

1.2.1 试验饲料的配制

柞蚕免疫蛹粉的制备参考文献[4]的方法，具体流程为：取健康的柞蚕蛹，按50 μL/头注射高效诱导源柞蚕链球菌(Streptococcuspernyisp. nov.)1212，置于20～22 ℃、自然光照下培养96 h，将诱导培养后的柞蚕蛹4 ℃下3000 r/min(离心半径18.9 mm)离心10 min，去掉蛹皮后，经喷雾干燥(控制条件为进口温度220 ℃，出口温度92～97 ℃)制成柞蚕免疫蛹粉。免疫蛹粉和普通蛹粉营养成分对比见表1。试验用基础饲料为颗粒饲料，购自大连天正实业有限公司，其营养成分见表2。

表1 免疫蛹粉和普通蛹粉营养成分对比(干质量) %Tab.1 Comparison of nutrients between immuned pupa powder andcommon pupa powder (dry weight)

表2 基础饲料营养成分(干质量)Tab.2 Nutritional content of basic diet (dry weight)

将免疫蛹粉分别以0.5%、1.0%、2.0%的比例添加到基础饲料中，另设基础饲料为空白组，同时设饲喂不经免疫诱导的普通柞蚕蛹粉作为对照组(添加量1%)，配制成5种红鳍东方鲀试验饲料，饲料现用现配。

1.2.2 试验设计及饲养管理

将225尾红鳍东方鲀随机分成5组，每组设3个平行，每个平行15尾鱼，于大连天正实业有限公司大黑石养殖场中暂养7 d后开始正式试验。用5种试验饲料投喂试验鱼，分别记为空白组、对照组、0.5%免疫蛹粉组、1.0%免疫蛹粉组、2.0%免疫蛹粉组，日投喂3次，投饵量为体质量的3%，循环水养殖，水温18～22 ℃，pH 7.5～8.0，24 h连续充氧，每日上午清理残饵和粪便，每周刷洗养殖水槽，试验周期30 d。

1.2.3 样品采集

试验结束后，称量各组全部红鳍东方鲀幼鱼的体质量并记录，计算其相对质量增加率(wWGR，%)。

wWGR=(mt-m0)/m0×100%

式中，m0为初始体质量(g)，mt为终末体质量(g)。

从每平行组随机选取6尾作为测定混合样本，用1 mL一次性注射器心脏取血，于4 ℃条件下凝结 6 h后离心[4 ℃，4000 r/min(离心半径5.9 cm)，10 min]，吸取上清液获得血清样品，-80 ℃冷冻备用。取血后鱼体组织用于测定肌肉成分，委托辽宁通正检测有限公司检测红鳍东方鲀鱼体蛋白质、脂肪、灰分和氨基酸含量。

1.2.4 血清酶活性测定

酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性均采用南京建成生物工程研究所试剂盒测定，详细步骤参见试剂盒说明书。

1.2.5 攻毒试验

养殖试验结束后，每组随机取10尾鱼进行病原菌攻毒试验。病原菌为哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)，经过二次培养活化后将菌液密度调至1.0×108cfu/mL，采用背部肌肉多点注射法，对红鳍东方鲀体内注射菌液0.1 mL。于水槽中养殖，观察10 d 内鱼的死亡情况，计算免疫保护率(Rm，%)。

Rm=(1-Re/Rb)×100%

式中，Re为试验组死亡率(%)，Rb为空白组死亡率(%)。

1.3 数据处理

试验数据均以平均值±标准差表示，使用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析，用Duncan法进行组间多重比较。

2 结 果

2.1 不同添加组红鳍东方鲀的质量增加率

由表3可见，与空白组相比，随着饲料中免疫蛹粉含量增加，各免疫蛹粉组质量增加率分别提高15.98%、18.89%和26.06%，均达到显著水平(P<0.05)，且2.0%组显著高于0.5%、1.0%组(P<0.05)。单独考察免疫蛹粉组和普通蛹粉组，结果表明，1.0%、2.0%免疫蛹粉组质量增加率提高达到显著水平(P<0.05)，可见柞蚕蛹经过免疫诱导后，对质量增加的效果更好。

表3 不同添加量免疫蛹粉对红鳍东方鲀质量增加率的影响(n=45)Tab.3 Effects of dietary immuned pupa powder (IPP) on the weight gain rate of tiger puffer T. rubripes

考察对照组与空白组发现，饲料中添加普通蛹粉对红鳍东方鲀质量增加率有一定提高作用，但差异不显著(P>0.05)。

2.2 不同添加组红鳍东方鲀的肉质成分

饲料中添加免疫蛹粉和普通蛹粉对鱼体肌肉肉质成分的影响见表4，饲料中添加普通蛹粉和免疫蛹粉对红鳍东方鲀肉质粗蛋白、粗脂肪、二十二碳六烯酸、氨基酸等营养成分均有提高作用，且各免疫蛹粉组均高于普通蛹粉组。考察不同免疫蛹粉组可知，随着免疫蛹粉添加量的增大，红鳍东方鲀肌肉中营养成分含量也升高。

表4 免疫蛹粉添加量对红鳍东方鲀肉质成分的影响(鲜质量) g/100 gTab.4 Effects of dietary immuned pupa powder (IPP) on the flesh composition of tiger puffer Takifugu rubripes (fresh weight)

2.3 不同添加组红鳍东方鲀非特异性免疫指标

与空白组和对照组相比，饲料中添加免疫蛹粉可显著提高红鳍东方鲀血清酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性(P<0.05)(图1～4)，但对溶菌酶活性影响不大(图5)。进一步考察表明，添加量对指标影响存在很大差异，其中，0.5%免疫蛹粉组红鳍东方鲀的酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性显著高于空白组和对照组，1.0%免疫蛹粉组碱性磷酸酶和过氧化氢酶活性显著高于空白组和对照组，2.0%免疫蛹粉组过氧化氢酶活性显著高于空白组和对照组，可见添加0.5%免疫蛹粉的综合效果最佳。

图1 饲喂不同比例柞蚕免疫蛹粉对红鳍东方鲀血清酸性磷酸酶活性的影响Fig.1 Effects of different doses of IPP on serum acid phosphatase (ACP) activity of tiger puffer T. rubripes标有不同字母表示组间有显著性差异 (P<0.05)，标有相同字母表示组间无显著性差异 (P>0.05)，下同.The means with different letters are significantly different in the groups at the 0.05 probability level and the means with the same letter are not significant differences, et sequentia.

图2 饲喂不同比例柞蚕免疫蛹粉对红鳍东方鲀血清碱性磷酸酶活性的影响Fig.2 Effects of different doses of IPP on serum alkine phosphatase (AKP) activity of tiger puffer T. rubripes

图3 饲喂不同比例柞蚕免疫蛹粉对红鳍东方鲀血清总超氧化物歧化酶活性的影响Fig.3 Effects of different doses of IPP on serum total superoxide dismutase (T-SOD) activity of tiger puffer T. rubripes

图4 饲喂不同比例柞蚕免疫蛹粉对红鳍东方鲀血清过氧化氢酶活性的影响Fig.4 Effects of different doses of IPP on serum catalase activity of tiger puffer T. rubripes

图5 饲喂不同比例柞蚕免疫蛹粉对红鳍东方鲀血清溶菌酶活性的影响Fig.5 Effects of different doses of IPP on serum lysozyme activity of tiger puffer T. rubripes

对照组中添加1%普通蛹粉，对红鳍东方鲀血清免疫指标的影响与空白组差异不显著(P>0.05)。

2.4 不同添加组红鳍东方鲀抗病力

红鳍东方鲀受到哈维氏弧菌攻击后，自第3天开始出现死亡，直至第7天，空白组全部死亡。统计其他组发现，饲料添加不同量免疫蛹粉均能降低红鳍东方鲀攻毒后的死亡率，其中0.5%组累计死亡率仅50%，为各组最低，其次是1.0%、2.0%组。对照组也能降低死亡率，但效果最差(表5)。

表5 攻毒后各组红鳍东方鲀死亡数、死亡率和免疫保护率Tab.5 The incidence of death number, mortality and immune protection rate in the different groups of tiger puffer T. rubripeschallenged with V. harveyi

3 讨 论

3.1 饲喂柞蚕免疫蛹粉对红鳍东方鲀体质量和肉质成分的影响

柞蚕免疫蛹粉是柞蚕蛹体被诱导出的抗菌蛋白、抗菌肽、溶菌酶和凝集素等生物抗菌素[7]，经喷雾干燥后制备而成的粉末，其中也含有其本身特有的营养物质。柞蚕蛹中蛋白质的含量达54%，且氨基酸组成接近联合国粮食及农业组织/世界卫生组织建议的蛋白质氨基酸组成模式，是理想的全价昆虫蛋白质[8]。这些营养物质对于动物的生长和发育具有促进作用，在水产动物中部分替代鱼粉能促进鱼的生长、改善肉质成分[9-11]。本试验中，对照组比空白组红鳍东方鲀体质量增加率略高，分析原因是添加柞蚕蛹粉提高了饲料蛋白质、氨基酸等成分含量，改善了饲料营养价值。此外，研究表明，柞蚕蛹经过免疫诱导后能显著提高红鳍东方鲀体质量增加率，这与在仿刺参(Apostichopusjaponicus)、凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)中的研究结果相似[5-6]。对仿刺参和凡纳滨对虾的研究表明，动物摄食柞蚕免疫蛹粉后，肠绒毛结构改善(结果待发表)，肠道菌群运算分类单元增加，乳酸菌、双歧杆菌(Bifidobacterium)和芽孢杆菌(Bacillus)等益生菌相对丰度显著提高，潜在致病菌相对丰度明显降低[12]。蛋白质组学研究进一步揭示，在摄食柞蚕免疫蛹粉的仿刺参肠道细胞中，差异表达蛋白中上调的蛋白大多富集在能量代谢的通路上[13]。因此，柞蚕免疫蛹粉提高动物体质量增加率可能与其优化肠道菌群以及改善肠道上皮细胞结构有关。

动物体营养成分组成变化直接决定了肉质和风味[14]，而鱼体营养成分与饲料密切相关[15-17]。本试验中，红鳍东方鲀摄食含免疫蛹粉饲料后，鱼体肉质成分得到明显改善，鲜味氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、丙氨酸)[18]含量提高，说明免疫蛹粉提供的营养成分通过合成代谢有效转化成肉质成分，不仅提高肉质营养价值，还提高了鱼肉的品质。普通蛹粉也能提高鱼体肌肉营养成分，但各成分含量低于免疫蛹粉添加组，这是因为免疫蛹粉组鱼的体质量更高，因此其肌肉营养成分就越高，这与在瓯江彩鲤(Cypinuscarpiovar.color)和杂交鲟(Acipenserschrencki♀×A.baeri♂)中的研究结果一致[19-20]。

3.2 饲喂柞蚕免疫蛹粉对红鳍东方鲀血清非特异性免疫酶活性的影响

鱼类非特异性免疫防御是抵抗病原最重要的屏障，其中发挥重要作用的是非特异性免疫酶[21]。这些免疫酶的功能各不相同，但相互协调共同维持机体的免疫防御和健康。在鱼体内，碱性磷酸酶和酸性磷酸酶在磷酸基团的代谢中发挥重要作用，它们也是鱼类体内巨噬细胞溶酶体的标志性酶，其活性的高低反映了溶酶体酶防御和消化功能的强弱[22]。溶菌酶为专门作用于微生物细胞水解的酶，是鱼类非特异性免疫的重要组成部分[23]。作为主要抗氧化保护的超氧化物歧化酶和过氧化氢酶，在抗衰老、抗炎症方面起着非常重要的作用[24]，超氧化物歧化酶和过氧化氢酶协同作用可分别清除机体内超氧阴离子自由基和自由基被分解过后的过氧化氢产物，其活性的高低可反映动物机体在胁迫环境下的免疫力[25]。本试验中，饲料中添加免疫蛹粉后，红鳍东方鲀血清碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性显著提高，表明免疫蛹粉能提高红鳍东方鲀免疫力和抗逆性，保证红鳍东方鲀免疫系统处于更为健康的状态。进一步研究发现，免疫蛹粉提高红鳍东方鲀免疫力具有剂量效应，饲料中免疫蛹粉含量过高其免疫提高效果反而有降低趋势，这可能与机体自我保护有关，具体机理需要进一步研究。

3.3 饲喂柞蚕免疫蛹粉对红鳍东方鲀抗病力的影响

考察动物攻毒后存活率能直观评价动物机体免疫抗病能力的高低。本试验中，摄食免疫蛹粉的红鳍东方鲀攻毒后存活率均比空白组和对照组提高，且存活率最高的是0.5%免疫蛹粉组，这同免疫酶指标结果一致。各试验组红鳍东方鲀在攻毒后均在同一天出现死亡，免疫蛹粉组并未出现死亡延后的现象，可能是样本量少，未体现出延缓死亡的效果，但明显降低累计死亡率，死亡率仅为空白组的一半。与之相比，饲料中只添加普通蛹粉对免疫指标和攻毒后存活率影响甚微，也说明免疫蛹粉中的活性成分发挥了重要作用。

柞蚕免疫活性物质究竟如何诱导动物机体产生免疫力是最终要阐明的。结合已有的研究，推测这种免疫调节作用极可能来自于肠道菌群的活动。免疫蛹粉中的活性成分体外被证实对多种致病菌具有广泛的抑菌和杀菌功能，但对有益菌无影响[26]。已经证实，进入肠道中的这些活性物质调节并改善了肠道菌群结构[12]，至于肠道菌群如何通过与宿主肠上皮细胞的免疫互作发挥免疫增强作用将是下一步研究的重点。

4 结 论

通过饲料中添加柞蚕免疫蛹粉提高红鳍东方鲀质量增加率、免疫力和抗病力，对实际养殖增收增产效果明显，有望开发成为新型生物抗菌素并在红鳍东方鲀健康养殖中使用。此外，我国蚕蛹类资源巨大，主要是作为食用资源开发利用。开发柞蚕蛹产品用于水产动物健康养殖不仅能扩展蚕桑资源应用领域，也为解决当下消费者关注的抗生素药物残留问题提供思路。综合成本和使用效果，建议在饲料中实际添加量不超过0.5%。