蔡碧莲，文亦磊

(1.广西中医学校，广西 南宁 530023；2.广西中医药大学第一附属医院病理科，广西 南宁 530023)

溃疡性结肠炎是一种尚未明确病因的慢性非特异性炎性肠病，主要表现为腹痛、黏液脓血便伴里急后重，病变累及部位主要为结直肠黏膜层和黏膜下层。因此，治疗该病的关键之处在于保护肠黏膜屏障、止血、修复肠壁溃疡等。龙血竭是一种经植物剑叶龙血树提取的树脂，具有活血散瘀、定痛止血、敛疮生肌等功效[1]，与现代医学治疗溃疡性结肠炎原则不谋而合。但目前对龙血竭的药理作用机制尚未深入研究，其效应成分也未见明确的文献报道。本研究通过网络药理学筛选了龙血竭有效成分、作用靶点及信号通路，从而构建龙血竭对治疗溃疡性结肠炎的“成分-靶点-疾病”网络，阐明龙血竭治疗溃疡性结肠炎的基本作用机制，以期为开发龙血竭资源并指导临床应用龙血竭治疗溃疡性结肠炎提供理论依据。

1 资料与方法

1.1资料来源 全文资料均在中药系统药理学分析平台数据库(TCMSP，http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)、有机小分子生物活性数据库(PubChem，https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、STRING 10.5数据库(http：//string-db.org)、GeneCards数据库(https：//www.genecards.org/)检索得出。

1.2方法

1.2.1龙血竭有效成分潜在靶点的筛选 以“龙血竭”为检索词，在TCMSP、PubChem检索其所含的有效成分及所对应潜在靶点，以口服利用度(OB)≥30%和类药性(DL)≥0.18作为筛选条件之一，剔除其中重复项及非人源的靶点，最终获得龙血竭有效成分相关的靶点信息。

1.2.2溃疡性结肠炎相关靶点的筛选 在GeneCards数据库中以“溃疡性结肠炎”为检索词进行相关靶点的检索，并对重复项进行剔除，取“Relevance score”在前200个疾病相关最高的靶点。

1.2.3龙血竭与溃疡性结肠炎相关靶点的筛选 将“1.2.1”项获得的龙血竭有效成分潜在靶点与“1.2.2”项获得的溃疡性结肠炎相关靶点进行Venny2.1交集比对分析，提取共同的靶点，采用蛋白互作网络(PPI)分析进一步明确龙血竭有效成分的潜在靶点与溃疡性结肠炎疾病靶点的关系。

1.2.4龙血竭对溃疡性结肠炎作用靶点的GO富集分析及KEGG富集分析 将上述靶点的简称以Gene Symbol格式上传至David数据库，进行GO富集分析、KEGG富集分析，P<0.05为差异有统计学意义。通过GO富集分析探讨龙血竭有效成分治疗溃疡性结肠炎潜在作用靶点的生物过程、分子功能、细胞成分等；KEGG富集分析探讨龙血竭治疗溃疡性结肠炎作用潜在靶点的通路分布。

1.2.5龙血竭“成分-靶点-通路”网络构建及核心靶点筛选 在Cytoscape软件中用不同颜色和形状代表有效化学成分、作用靶点、作用通路等。用“边”连接有效化学成分和作用靶点，以及作用靶点和其注释的相关作用通路，由此构建“成分-靶点-通路”网络探讨龙血竭多成分、多靶点、多通路治疗溃疡性结肠炎的作用机制。

2 结 果

2.1龙血竭有效成分及有效成分潜在靶点 龙血竭主要化合物有黄酮类、查耳酮类、多聚查耳酮类、黄烷类、高异黄烷类等多种化合物。但以OB≥30%、DL≥0.18和Lipinski原则为标准最终筛选出14种化合物，其潜在作用靶点及数量见表1。龙血竭有14种化合物、90个作用靶点，得出以下结论：(1)龙血竭具有多成分、多靶点的作用特点；(2)在不同的化合物中可能存在相同的作用靶点。此网络涉及的节点数为91个，节点与节点之间的边数为710条，平均节点度为15.6，聚类系数为0.592。

表1 龙血竭的化合物及潜在作用靶点

续表1 龙血竭的化合物及潜在作用靶点

2.2溃疡性结肠炎靶点与龙血竭靶点比较 通过GeneCards数据库初步筛选出4 356个疾病候选基因，根据“Relevance score”读取最高的前200个结果，与溃疡性结肠炎相关发病机制靶点进行比对，得出龙血竭与溃疡性结肠炎相关发病机制的17个作用靶点基因，进一步说明了龙血竭与溃疡性结肠炎的靶向作用关系。龙血竭成分靶点与溃疡性结肠炎相关发病机制靶点韦恩图见图1。从龙血竭有效成分对溃疡性结肠炎的作用靶点的PPI网络关系可知，聚类系数为0.825，平均节点度为11.765，平均最短路径为1.625，其中17个重叠靶点是该药与疾病作用的关键分子基础，并在关系网络中体现了较好的连通特性。

图1 龙血竭成分靶点与溃疡性结肠炎相关发病机制靶点韦恩图

2.3龙血竭对溃疡性结肠炎作用靶点的GO分析和KEGG分析 采用David数据库筛选龙血竭对治疗溃疡性结肠炎主要涉及的内容为生物过程25个，包括一氧化氮生物合成过程的正调控、药物反应、细胞增殖的负调控、细胞氧化解毒、凋亡过程的负调控等；细胞组成13个，包括细胞外、血小板α颗粒内腔、高尔基体、内体腔、胞外区等；分子功能16个，包括血红素结合、受体结合、转录调控区 DNA 结合、蛋白磷酸酶结合、前列腺素-内过氧化物合酶活性等，差异均有统计学意义(P<0.05)。采用David数据库筛选龙血竭对治疗溃疡性结肠炎的相关信号通路，KEGG通路富集分析结果显示，龙血竭中90个潜在作用靶点涉及缺氧诱导因子1(HIF-1)信号通路、肿瘤信号通路、转录调节因子(FoxO)信号通路、炎症性肠病信号通路、HTLV-I感染、脂肪细胞中脂解的调节、产生免疫球蛋白A的肠道免疫网络等25条通路。

2.4龙血竭“成分-靶点-通路”网络分析及核心靶点 采用Cytoscape3.6.1软件构建龙血竭治疗溃疡性结肠炎的“成分-靶点-通路”网络，从该网络可知，龙血竭预测出的14种有效成分，14种有效成分预测出的90个潜在靶点，90个潜在靶点与溃疡性结肠炎的25条交集通路。该网络涉及129个节点，514条边，平均最短路径为3.62，平均节点度为3.98，平均中心接近度为0.29，网络中心度为4.05。

3 讨 论

溃疡性结肠炎的发生与发展受多种因素、多种细胞和多条信号通路的调控而形成的复杂生物学过程[2]。网络药理学通过筛选药物活性成分、靶点，构建“成分-靶点”网络；对疾病发病机制靶点核查对比，构建“成分-靶点-疾病”网络；并构建“成分-靶点-通路”网络的体系。网络药理学从传统的“单靶点、单通路”的研究角度转变为“多成分、多靶点、多通路”的研究理念与方法[3]。从而阐明中药成分、靶点、疾病之间的网络关系，为中医药科学内涵提供了理论依据及新的研究思路。

本研究通过网络药理学方法预测了龙血竭治疗溃疡性结肠炎的有效成分和药物靶点蛋白，并与溃疡性结肠炎发病机制的靶点核查对比的靶点而得到的交互蛋白，从而构建“成分-靶点-疾病”网络。通过筛选得到的这些蛋白——IL-6、SMAD3、STAT3、干扰素均与溃疡性结肠炎密切相关。并且在KEGG富集通路分析所获取的“成分-靶点-通路”中，通过查阅文献可知，这些通路与炎性反应有直接或间接的关系，作者考虑龙血竭主要通过影响这些炎症通路，从而发挥治疗溃疡性结肠炎的作用。此外，近年来对溃疡性结肠炎相关的信号通路的研究表明，与溃疡性结肠炎具有相关性的通路有肿瘤信号通路[4-5]、炎症性肠病信号通路[6-7]、HIF-1信号通路[8-9]、FoxO信号通路[10]、肿瘤坏死因子信号通路[11]、Jak-STAT信号通路[12]和磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号通路[13]。

作为一种辅助性T淋巴细胞1型促炎性细胞因子的IL-6，是由单核细胞、巨噬细胞和T淋巴细胞分泌的，在免疫调节、炎性反应、肿瘤发生等过程中具有重要作用。IL-2作为其中的一种抑炎性细胞因子，通过诱导淋巴细胞分化、增殖，增强自然杀伤细胞和T淋巴细胞活性，促进B淋巴细胞分化、增殖，从而调节免疫系统，延缓或阻止溃疡性结肠炎的发生与发展。原本静息态的信号传导蛋白和STAT3在某些因素的刺激下转变为活化STAT3，是溃疡性结肠炎的发生与发展不可或缺的重要分子，若活化STAT3出现过表达还可使炎症向肿瘤转化[14]。有研究通过三硝基苯磺酸/乙醇法构建了大鼠溃疡性结肠炎模型，治疗组予以甘草泻心汤各剂量灌胃治疗，与模型组比较，甘草泻心汤各剂量组血清谷草转氨酶水平均降低，甘草泻心汤中剂量组结肠组织病理评分明显降低，结肠组织中IL-6、STAT3蛋白及mRNA表达均明显降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。表明甘草泻心汤可能是通过降低结肠组织中IL-6、STAT3的表达，抑制IL-6/STAT3信号传导通路，改善溃疡性结肠炎大鼠的结肠结构[15]。翟月华等[8]观察了自拟清肠愈疡汤经验方口服、中药灌肠对重度溃疡性结肠炎患者肠道菌群、血清HIF-1α、转化生长因子-β1(TGF-β1)、β-内啡肽(β-EP)水平的影响。结果显示，观察组患者血清HIF-1α、TGF-β1、β-EP水平降低程度明显优于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。表明重度溃疡性结肠炎患者经自拟清肠愈疡汤经验方口服、中药灌肠进行中医内外合治能改善其临床症状。考虑可能是与抑制血清HIF-1α、TGF-β1、β-EP过表达而实现修复肠黏膜上的溃疡，使之愈合并恢复其屏障功能。

综上所述，本研究基于网络药理学得知，龙血竭有14种有效成分可直接或间接地作用于IL-6、SMAD3、STAT3、干扰素等90个核心靶点，并富集到肿瘤信号通路、炎症性肠病信号通路、HIF-1信号通路、FoxO信号通路、肿瘤坏死因子信号通路、Jak-STAT信号通路和磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号通路上，相互协调，通过多种途径发挥保护肠黏膜和修复肠壁溃疡的作用。本研究初步揭示了龙血竭治疗溃疡性结肠炎可能的网络，为龙血竭治疗溃疡性结肠炎的进一步实验研究及临床应用提供了参考依据。但网络药理学方法也存在着一定的局限性，如非核心靶点是否具有药理作用、龙血竭在体内代谢产物是否对作用机制有影响均有待于下一步的实验验证。