王 萌，胡金朋，王振国，滕 川

胆囊癌(gall bladder cancer，GBC)是一种总体发病率较低但预后较差的恶性疾病，5 年生存率约为5%。由于GBC的发病隐匿、进展迅速、侵袭性高，大多数患者错过了手术机会，即使行根治性手术，大多数患者仍会因早期转移和辅助治疗有限而复发。近年来，胆道系统癌症的综合基因组分析取得了重大进展，成纤维细胞生长因子受体 (fibroblast growth factor receptor，FGFR) 家族是细胞表面受体酪氨酸激酶，通过与其配体成纤维细胞生长因子 (fibroblast growth factor，FGF) 相互作用广泛参与细胞增殖、分化和迁移。然而，FGFR4的致癌作用仍存在争议，涉及FGFR4的肿瘤进展的分子机制尚不清楚，直到 2015 年才研究出 FGFR4的特异性抑制剂。有研究发现，miR-7-5p可能在GBC-SD细胞中抑制FGFR4表达。Tian等发现，miR-7-5p/FGFR4轴可促进肝星状细胞活化。因此，本研究旨在探究miR-7-5p/ FGFR4轴与GBC预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2016-06至2018-06武警特色医学中心普外科行手术切除的GBC患者47例，收集胆囊癌组织(GBC组)及癌旁组织(PCLT组)，再选取同期良性胆囊疾病患者43例，收集良性胆囊组织(NC组)。纳入标准：(1)经病理学检查证实为胆囊癌；(2)术前常规检查结果正常，无胆囊癌根治术禁忌；(3)患者和家属对本研究知情同意。排除标准：(1)合并其他恶性肿瘤；(2)失访或中途退出。随访25～64个月，平均(41±15)个月。47例GBC患者中，男23例，女24例，年龄36～78岁，平均(60.31±10.35)岁；43例良性胆囊患者中，男22例，女21例，年龄32～79岁，平均(58.43±11.26)岁，两组性别年龄比较，差异无统计学意义，具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准(审批号：201605001)。

1.2 试剂 trizol提取试剂盒、实时荧光定量 PCR 试剂和试剂盒购自赛默飞世尔科技(上海)公司。

1.3 实时定量PCR 使用trizol提取总mRNA，按照表1中列出的靶基因特异性引物的序列，使用ReverTra Ace qPCR RT试剂盒进行cDNA的合成，SYBR Green实时PCR预混试剂盒进行反转录酶qPCR分析， StepOnePlus实时荧光定量PCR仪实时定量PCR，实时PCR数据分析以β-actin为内参，采用2法分析。

表1 实时PCR中使用的引物序列

2 结 果

2.1 miR-7-5p、FGFR4在非胆囊癌组织、癌旁组织和胆囊癌组织表达差异及相关性 与NC组相比， GBC组和PCLT组的miR-7-5p mRNA表达水平下降，FGFR4 mRNA表达水平升高，差异具有统计学意义(<0.05)。与PCLT组相比，GBC组的miR-7-5p mRNA表达水平下降， FGFR4 mRNA表达水平升高，差异具有统计学意义(<0.05，表2)。在NC组中，miR-7-5p mRNA与FGFR4 mRNA相关(=-0.524，=0.010)，在PCLT组中，miR-7-5p mRNA与FGFR4 mRNA不相关(=-0.373，=0.055)，在GBC组中，miR-7-5p mRNA与FGFR4 mRNA相关(=-0.535，=0.004)。

表2 胆囊癌和非胆囊癌患者miR-7-5p/FGFR4 mRNA表达水平

2.2 胆囊癌患者一般资料 47例胆囊癌患者按照FGFR4的表达情况分为低表达亚组(23例)和高表达亚组(24例)，两组患者性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义，具有可比性(表3)。两组的肿瘤分期、肿瘤的分化程度、淋巴结转移及术后放化疗之间差异有统计学意义(<0.05)。

表3 胆囊癌患者一般资料 (n;%)

2.3 miR-7-5p/FGFR4 mRNA表达水平与GBC术后总生存期的关系 按miR-7-5p表达水平将47例分为miR-7-5p低表达亚组(miR-7-5p Low)23例和miR-7-5p高表达亚组(miR-7-5p High)24例，miR-7-5p低表达亚组生存率低于miR-7-5p高表达亚组，差异有统计学意义(=-0.726，=0.047，图1A)；按FGFR4表达水平将47例分为FGFR4低表达亚组(FGFR4 Low)23例和FGFR4高表达亚组(FGFR4 High)24例，FGFR4低表达亚组生存率高于FGFR4高表达亚组，差异有统计学意义(=2.108，=0.033，图1 B)。

图1 胆囊癌患者术后总生存期

2.4 miR-7-5p及FGFR4的ROC曲线 miR-7-5p的ROC 曲线下面积为0.692(95%：0.538～0.846)，当诊断界值确定为0.366时，miR-7-5p 诊断GBC的敏感度为78.3%，特异性为58.3%；FGFR4 的ROC 曲线下面积为0.709(95%：0.555～0.863)，当界值确定为0.409 时，FGFR4 诊断GBC的敏感度为82.6%，特异性为58.3%(图2)。

图2 胆囊癌患者miR-7-5p及FGFR4的ROC曲线

3 讨 论

GBC是胆管最常见的癌症，由于早期诊断困难，术前诊断率只有30%，大多数患者是在手术时或术后病理检查中偶然发现。对于有症状的 GBC即使行R0切除后，5年内复发的风险仍为64%。GBC的临床预后很差，虽然在早期(T)手术的5年生存率可以达到75%，但总体5年生存率低于5%。因此，寻找GBC发生发展过程中的关键基因和相应的蛋白产物，可能对GBC患者诊断和治疗提供帮助。

MicroRNA (miRNA) 是约 22 nt 的小非编码 RNA，在信使 RNA (mRNA) 的转录后调控中起重要作用。许多miRNA 可以作为致癌基因或肿瘤抑制基因，miRNA 表达的失调与癌症的发生、进展和转移密切相关。先前有报道称 MiR-7-5p 是多种癌症类型中的肿瘤抑制因子，并抑制肿瘤的生长和侵袭。Xiao发现，MiR-7-5p通过靶向NOVA2抑制非小细胞肺癌的转移。Shi等发现，miR-7-5p下调通过靶向KLF4抑制食管癌的发生。Yin等发现，miR-7-5p通过靶向SATB1抑制胶质母细胞瘤细胞迁移和侵袭。本研究发现，miR-7-5p在GBC癌旁组织和癌组织中显著下调，miR-7-5p低表达患者预后生存率明显低于miR-7-5p高表达患者，miR-7-5p表达水平与GBC患者预后呈正相关关系；ROC曲线分析结果表明，miR-7-5p诊断GBC的敏感度为78.3%，特异性为58.3%，可能为GBC的诊断提供参考。

FGFR4 是 FGFR 家族的成员，包含酪氨酸激酶结构域，在胚胎发育、组织修复、肿瘤血管生成和肿瘤进展中起着关键作用。据报道，FGFR4 在多种实体瘤中过度表达，包括肝细胞癌、乳腺癌、口咽鳞状细胞癌和胰腺癌等。本研究发现，FGFR4在GBC组织和GBC癌旁组织中高表达，且与抑癌基因miR-7-5p表达水平负相关。FGFR4 中的遗传畸变在各种类型的癌症中普遍存在，基因扩增是所有 FGFR4 基因改变中最常见的改变类型，这些畸变预示着不良预后。在本研究中，高表达FGFR4的患者预后生存率显著低于FGFR4低表达的患者，与文献[14]研究结果一致。FGFR4 诊断GBC的敏感度为82.6%，特异性为58.3%，可能为GBC的辅助诊断提供参考。FGFR4 畸变导致下游信号通路的失调，如与细胞的增殖、侵袭和凋亡相关的Ras/Raf/MAPK 和 PI3K-AKT 通路，是两种在癌症中经常失调的主要通路。当畸变的FGFR4 被激活时，磷酸化的 FGFR4 会募集并磷酸化细胞内特异性接头蛋白，随后激活 RasRaf-MAPK 通路。另一方面，激活的FGFR4 磷酸化磷脂酶 Cγ，进而激活蛋白激酶 C，随后刺激Ras/Raf/MAPK 通路。除此之外，FGFR4 通过增强 GSK3β-βcatenin 信号，从而诱导 EMT增加。异常激活的 FGFR4可能促进了这些癌症的形成，FGFR4已成为抑制癌症发展的潜在目标。

FGFR4 的单一配体结合域能够与其特异性配体进行高亲和力结合，这表明有可能开发出高度特异性的抑制剂。关于FGFR4的小分子抑制剂的开发是近几年才取得突破的。选择性小分子 FGFR4 抑制剂 BLU9931在肝细胞癌和GBC中表现出显著的FGFR4 抑制作用，抑制肿瘤细胞的增殖和侵袭。选择性 FGFR4 靶向已被证明可减少不良反应，同时靶向 FGFR4 和其他受体酪氨酸激酶已被证明可通过肿瘤微环境的正常化间接增强抗肿瘤活性。这进一步证明，FGFR4是GBC治疗的靶点，具有十分重要的临床意义。而以FGFR4为靶点的miRNA的研究有限，Tian等发现，在肝脏中miR-7-5p可以靶向FGFR4，本研究同样证实，miR-7-5p和 FGFR4表达负相关，二者均可作为GBC的诊断的辅助指标。因此，本研究推测，对 miR-7-5p/FGFR4轴的进一步研究可能对GBC的治疗有一定的帮助。但是，由于本研究的样本量较小，未来还需要扩大样本量，关于miR-7-5p的体内实验尚属空白，其与FGFR4特异性抑制剂BLU9931的效果差异仍不清楚，未来将进一步研究。

总之，本研究发现，miR-7-5p/FGFR4轴可能影响GBC的临床预后，是未来GBC治疗有意义的方向。