位亚利，孙珵珵，王晓春

(河北大学附属医院，河北 保定 071000)

乳腺癌占女性恶性肿瘤的首位。据2020年全球癌症中心数据统计，全球乳腺癌新发病人数高达226万例，超过了肺癌，位居榜首[1]。尽管如今对乳腺癌分子分型的理解越来越深入，提供了更加精准的个体化治疗来延长患者的生存期，但是仍然有许多患者没有从中获益，尤其是对于预防乳腺癌的复发及转移依旧没有行之有效的办法。三阴性乳腺癌是最具挑战性的乳腺癌亚型，该型乳腺癌缺乏雌激素受体、孕激素受体、HER2作为治疗靶点，容易复发和转移，导致预后较差[2-3]。因此在乳腺癌的预防和治疗中需要探索其侵袭和转移的机制，将研究结果更好地应用于临床。

1 血管拟态的生物学特性

肿瘤血管和肿瘤的生长、转移和侵袭等有着密切的关系。研究表明，当实体肿瘤直径<2 mm时，可以通过扩散获得氧气和营养物质。然而，一旦超过这个体积，实体肿瘤的中心就不能单纯通过扩散获得足够的氧气和营养物质，这一区域的肿瘤细胞就会暴露在缺氧的微环境中[4-5]。为了满足肿瘤不断增殖的需要，肿瘤细胞在缺氧的影响下会发生适应性改变，从而向恶性程度更高的方向演变。相关研究表明，随着肿瘤的不断生长，肿瘤需要新的血管运输氧气和营养[6]。近年来，对于肿瘤血管的研究不断深入，揭示了传统的肿瘤血管的生成途径[7]。基于这一研究方向，许多靶向药物已经投入到临床使用，但效果并不理想。因此一些研究人员指出，抑制经典途径可能激活了其他血管生成的过程[8]。血管拟态是近年来发现的一种存在于多种恶性肿瘤的血管生成模式，该发现为临床肿瘤治疗提供了新的策略。血管拟态是内皮血管形成的前体，最早于1999年由Maniotis等[9]在研究人眼葡萄膜黑色素瘤中发现的一种不依赖于内皮细胞仅由肿瘤细胞和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)相互作用的肿瘤微环境模式，这种网络状结构目前通过过碘酸-雪夫氏染色阳性和CD31、CD34等多种内皮细胞标志物染色为阴性来鉴定。随后，在其他肿瘤中相继报道了血管拟态，例如乳腺癌、卵巢癌、骨肉瘤、胶质母细胞瘤和胆囊癌等[10-14]。由于血管拟态中的微血管壁只有单层肿瘤细胞而没有内皮细胞作为屏障，当肿瘤细胞释放蛋白酶以溶解ECM之后，它们就会直接暴露在血液中，这样就促进了肿瘤细胞的转移。由此推测正是由于血管拟态的出现导致许多抗血管药物出现耐药性，因此将抗血管生成与抑制血管拟态2种治疗相结合可以最大程度抑制肿瘤血管化，从而降低癌症转移和复发的概率。

2 血管拟态的发生机制

2.1 血管拟态的分子机理

相关研究已经发现了调节血管拟态的几个因素，其中，包括缺氧诱导因子1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)、上皮钙粘着蛋白(epithelial-cadherin, E-cadherin)、层粘连蛋白5γ2等相关分子，但详细的调控机制不详[15]。E-cadherin在内皮细胞中特异性表达，主要作用是介导细胞之间相互黏附，稳定内皮细胞的连接。E-cadherin作用于促红细胞生成素生成肝细胞受体A2(erythropoietin-producing hepatocelluar A2,EphA2)，使其与相应的配体结合后磷酸化，激活的EphA2激活PI3K，PI3K进一步上调基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase,MMP2)的表达，导致层粘连蛋白5γ2片段的裂解，最终促进血管拟态的形成[16]。在食管癌的细胞系中，观察到抑制HIF1α可以抑制血管拟态的形成，并降低E-cadherin、EphA2和层粘连蛋白5γ2的表达[17]。

另一方面，一些微小核糖核酸(miRNA)与血管拟态的调节具有相关性。miRNA 是非编码的20-24碱基的RNA，与mRNA共同作用控制基因的表达，miRNA可以减少转录或阻止翻译。在癌症研究中，已发现不同的miRNA可以调控原癌基因和抑癌基因[18]。另外miRNA也可通过与特定基因相互作用来调节血管拟态的形成；例如，通过在人神经胶质瘤细胞及其衍生的细胞系进行各种体内外实验证实了miR-141与EphA2的表达呈负相关，并且外源性miR-141抑制了血管拟态的发展，降低了胶质瘤增殖、侵袭和迁移的能力。进一步用荧光素酶实验鉴定其靶基因证实了EphA2是miR-141在胶质瘤细胞中的直接靶点，而miR-141是通过调控EphA2基因的表达进而影响细胞迁移、侵袭的能力以及血管拟态的形成过程[19]，由此可见，EphA2连接着多条信号通路，进而影响血管拟态的形成，因此，EphA2将有望成为一个新的诊断及预后生物标志物和抗血管拟态治疗的靶点。首尔女子大学生物科学系Lim等[20]首次培养了7种乳腺癌的细胞系，发现miR-34a通过调节AXL的表达来调节肿瘤的侵袭性和血管拟态的形成。An等[21]证实了敲除miR-93可以抑制MDA-MB-231细胞系中血管拟态的形成，此外，他们利用基因芯片技术检测了miRNA在三阴性乳腺癌和相应的癌旁组织的差异表达，结果显示miR-93的表达在三阴性乳腺癌组织中明显上调。进而利用生物信息技术对miR-93的靶基因进行分析，证明这些靶基因均促进了肿瘤细胞的侵袭和迁移。不难看出，多种miRNA均可作用于相关的靶基因，从而影响血管拟态的形成。

2.2 血管拟态与肿瘤干细胞

除了上述决定因素外，血管拟态还与肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)的特性有关。美国癌症协会将CSCs定义为一种具有自我更新能力和多向分化潜能肿瘤细胞类型[22]，这类细胞在耐药中起着至关重要的作用，因为它们能够在常规治疗中存活下来，从而导致肿瘤的转移和复发。早在Maniotis等人阐述血管拟态时，他们就通过cDNA微阵列分析比较了高侵袭性和低侵袭性黑色素瘤细胞，发现血管拟态在侵袭性黑色素瘤细胞表现出多能胚胎样基因型[23]。由此推断CSCs与血管拟态的形成存在密切的关系。CSCs具有特定的标志物，包括CD44、CD133、CD166、ALDH等[24]。CD44+CD24-为乳腺CSCs标志物，MDA-MB-231细胞株通常侵袭性强，同时MDA-MB-231细胞株中CSCs的比例远高于其他细胞株。因此天津医科大学病理科团队在小鼠体内植入MDA-MB-231和MCF-7 2种乳腺癌细胞株，其中MDA-MB-231细胞株中血管拟态的形成能力更强，可以说明CSCs有可能参与了血管拟态的形成。紧接着他们使用三维重建显示CSCs与血管拟态的空间关系，又证实了CSCs直接参与三阴性乳腺癌中血管拟态的形成[25]。而后在一项包含134例乳腺癌样本的研究中，研究人员了解到MDA-MB-231细胞CD133+亚群表达更高水平的血管拟态的相关蛋白，如E-cadherin、MMP2和MMP9，并能形成血管拟态，再次证明CD133+CSCs也和血管拟态的形成有关。再后来Liu等[26]对三阴性乳腺癌细胞系HCC1973/p53的研究显示，经过荧光细胞分选术后，ALDH+细胞在基质胶上明显形成血管拟态，而ALDH-细胞则不形成血管拟态。以上实验通过CSCs不同的标志物从多角度说明CSCs可能参与了乳腺癌中血管拟态的形成过程。此外，CSCs可能提供更多的与血管拟态相关的因子协同形成血管拟态，例如，在一项体外研究中，报道了TGF-β超家族成员Nodal蛋白由CSCs表达，以维持其干细胞样特性，并通过Smad2/3信号通路促进血管拟态的形成[27-28]。综上所述，CSCs通过促进血管拟态相关基因表达和内皮样表型进而影响血管拟态形成，而抑制CSCs的发生发展有可能成为未来抑制血管拟态形成的重要研究方向。

2.3 血管拟态与上皮间质化

CSCs的其中一个重要特性就是细胞可塑性。细胞可塑性是指细胞能够改变其表型以适应环境的能力。肿瘤微环境的各种成分，控制着CSCs表型的转换，有利于化疗耐药、免疫逃逸、肿瘤细胞侵袭和转移的发生[29]。这种表型的转换与上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)有着密切关系。

EMT指具有极性的上皮细胞去极性后转化为间质细胞，该过程与胚胎发育、组织重构、炎性反应及肿瘤转移等多种病理生理过程有关[30]。细胞可塑性最关键的机制之一就是EMT，发生EMT 时，上皮细胞中E-cadherin的表达受到抑制，导致上皮细胞由典型的多边形或鹅卵石形转变为纺锤形的间质细胞形态，迁移能力提高，并可表达间质细胞相关标志物，如神经钙黏蛋白、波形蛋白和纤连蛋白等[30]。EMT的激活导致细胞极性丧失、细胞间连接破坏、基底膜降解和细胞外基质重塑。因此大量研究证明，EMT赋予癌细胞更大的转移潜能，这也就与血管拟态的形成有着密不可分的联系。例如An等[21]敲除miR-93后抑制了MDA-MB-231细胞系中血管拟态的形成，在这过程中发现提高了上皮细胞标志物表达，降低了间质细胞标志物表达，提示miR-93可能通过EMT促进血管拟态的形成。另外，EMT受到多种转录因子Snail，ZEB、Twist和TGF-β、Wnt、Notch 等信号通路的调节。这些转录因子促进EMT的主要机制是通过抑制上皮细胞之间的连接所需基因的表达从而抑制肿瘤细胞的上皮表型、增强其间充质特性。既然EMT过程与血管拟态的形成有关系，那么这些能够影响EMT过程的转录因子势必也能够影响血管拟态的形成。例如，用TGF-β-1诱导肺磷癌细胞发生EMT。经TGF-β-1处理的SK-MES-1细胞Twist1表达增强。经TGF-β-1处理后，上皮细胞表型、血管拟态及迁移和侵袭能力增强。重要的是，在TGF-β-1处理的细胞中，Twist1基因敲除后，PSCC细胞的EMT表型逆转，血管拟态标志物表达减少，迁移和侵袭能力降低[32]。从侧面说明Twist1将来有望成为抑制血管拟态形成和影响EMT过程的重要靶点。另一方面，EMT程序的激活使得肿瘤细胞获得 CSCs 特征[33]。在永生化乳腺上皮细胞中，SNAIL的过表达增加了CD44+CD24-细胞的比例。此外，CD44+CD24-细胞显示出EMT 不同的形态。在通过引入HER2/neu基因转化的细胞中也观察到了这种现象[34]。许多研究也强调了EMT与CSCs之间的密切关系，因为CSCs在癌症治疗后表现出EMT特点，从而导致疾病复发和转移[35]。例如三阴性乳腺癌中的CSCs由于其固有的间充质侵袭性表型，表现出很强的分化能力[36]。除此之外，三阴性乳腺癌中的CSCs具有细胞可塑性，还可以表现出内皮细胞的形态并表达特定的标志物，如E-cadherin，从而有助于形成血管拟态[26]。不难看出，EMT的激活、CSCs的增殖以及血管拟态的形成这三者之间相互作用、错综复杂，共同影响肿瘤的侵袭和迁移。而这之间详细的调控信号通路还有待进一步研究。

3 血管拟态与乳腺癌病理特征之间的关系

乳腺癌中血管拟态的存在与几种临床参数的预后有关，在更高的淋巴结转移组且诺丁汉预后指数(Nottingham prognostic index,NPI)较差的队列中，血管拟态的发生率更高，血管拟态与雌孕激素受体的表达负相关，另外，三阴性乳腺癌中血管拟态的发生率明显高于非三阴性乳腺癌[37]。除此之外，一些研究还报告了调节乳腺癌中血管拟态过度表达的相关因素，例如HIF1α、E-cadherin和EphA2[38-41]。

4 血管拟态作为治疗目标

如上所述，血管拟态的形成与诸多因素有关，因此，对于血管拟态的抑制性治疗可以针对以上任何一个过程。北京大学药学院团队人员[42]对侵袭性人乳腺癌MDA-MB-435S细胞和MDA-MB-435S裸鼠移植瘤进行了研究，证明了用表阿霉素和塞来昔布纳米靶向脂质体可以杀伤乳腺癌细胞并抑制血管拟态形成，体外实验结果表明，靶向脂质体具有较强的跨细胞和跨核膜转运能力，能够穿透和破坏浸润性乳腺癌细胞，通过激活凋亡蛋白酶启动细胞凋亡，并通过下调侵袭性乳腺癌细胞的蛋白水平，如MMP9、E-cadherin、EphA2和HIF1α等来破坏血管拟态的形成过程。次年，该团队又构建了靶向分子修饰的功能性长春新碱加达沙替尼脂质体，察觉到该种脂质体具有相同的作用，此外，这种脂质体的使用使裸鼠异种移植瘤的体积明显减小了[43]。6,6′-双(2,3-二甲氧基苯甲酰基)α，α-D-海藻糖[6，6′-bis(2，3-dimethoxybenzyloxy)-α，αD-trehalose，DMBT]具有多种抗肿瘤侵袭和转移的活性，有研究表明DMBT通过抑制HIF1α/VE-cadherin/MMPs信号通路抑制缺氧诱导的血管拟态形成[44]。除此之外，某些中药也能够通过抑制血管拟态形成从而达到抗肿瘤生长的作用。例如马钱子碱是从马钱科马钱子中提取的一种传统中草药，曾经在多种肿瘤模型中显示出抗肿瘤活性。在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中，高浓度的马钱子碱在诱导细胞凋亡的过程中对细胞增殖有剂量依赖性的抑制作用。进一步研究表明，马钱子碱在抑制血管拟态形成时同样呈剂量依赖性，可能是通过下调EphA2/MMP9/MMP2等相关蛋白抑制血管拟态形成[45]。

另一方面，也有人提出抑制肿瘤血管形成的最佳策略是同时抑制血管生成和血管拟态的形成。贝伐单抗曾经是美国FDA批准上市的一种血管生成抑制剂，通过与VEGF结合并阻断其活性而起作用。这在肿瘤的靶向治疗中有显著的抑制肿瘤血管形成效果，但是容易产生耐药性，并且不良反应较多，在实际临床应用中效果较差[46]。大多数血管生成抑制剂都易产生耐药性，但是，由于抗血管生成耐药性不是由遗传因素引起的，是可以逆转的。耐药机制包括血管生成、肿瘤血管保护、肿瘤细胞侵袭性增加以及血管拟态形成促进肿瘤转移等[47]。目前主要的耐药机制是当抗血管生成药物应用时会代偿性地促进血管拟态的形成，而这种血管拟态增殖后不但会产生耐药性，还会加剧肿瘤的侵袭和转移。而近年来研究人员也开发了一些能够抗血管生成同时抗血管拟态形成的药物。例如上海医药卫生大学药学院团队人员利用杂交瘤技术和抗体人源化技术产生特异性针对Fzd7的抗体SHH002-hu1。Fzd7是Wnt/β-catenin信号传导的关键受体蛋白，通过一系列体内外研究证明，SHH002-hu1通过阻断Wnt/β-catenin信号抑制三阴性乳腺癌的生长。此外，当与贝伐单抗联合使用时，SHH002-hu1通过阻断Wnt/β-catenin信号通路逆转了由贝伐单抗产生的缺氧诱导的三阴性乳腺癌CSCs的增加，通过减少血管拟态的形成阻止了贝伐单抗诱导的血管生成反弹，并且能够抑制HIF1α的转录活性和缺氧相关蛋白的表达，揭示了SHH002-hu1增强TNBC适应缺氧的能力[48]。褪黑素本来是可以诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞转移的一种氨基酸衍生物[49]。复旦大学上海医学院妇产科团队曾经报道了褪黑素可以选择性抑制缺氧条件下血管内皮生长因子的释放和活性氧的产生来抑制血管形成[50]。不久，Maroufi等[51]进一步证明褪黑素通过影响血管拟态结构和EMT形成中的重要分子预防血管拟态的形成。因此，单单对抗经典的血管生成过程是远远不够的，由于血管拟态的特殊性，传统的抗血管药物无法阻断血管拟态继续给肿瘤组织输送新鲜的血液和营养，必须双管齐下，将抗血管生成治疗和抗血管拟态治疗联合起来才能取得令人满意的效果。

5 不足与展望

综上所述，血管拟态作为一种全新的肿瘤微循环模式受到人们的关注，并且与乳腺癌的临床预后及肿瘤的侵袭、转移有密切关系。而血管拟态的形成机制较为复杂，与多种信号通路、CSCs、EMT等过程有着密切联系，然而具体机制尚需进一步探索。靶向形成血管拟态过程中的关键蛋白能够从根源上抑制血管拟态的形成，从而抑制乳腺癌尤其是三阴性乳腺癌的转移和侵袭。临床上许多抗血管药物治疗效果不理想可能与血管拟态的形成有关。虽然现有的研究表明多种天然化学物质及一些靶向药物能够抑制血管拟态的形成，但具体的作用形式及作用机制还需要进一步探究。未来抗血管生成同时抗血管拟态治疗将有望成为乳腺癌治疗的新方向。