杨 文 ,宋 丹 ,宋纯东 ,郭 婷 ,段凤阳 ,王宁丽 ,张 博,杨 濛

(1.河南中医药大学儿科医学院,郑州 450046;2.河南中医药大学,郑州 450046;3.河南中医药大学第一附属医院儿科,郑州 450003)

IgA 肾病(IgA nephropathy,IgAN)是我国最为常见的原发性肾小球疾病,以免疫球蛋白 A(immunoglobulin A,IgA)或IgA 免疫复合物(immune complex,IC)沉积于肾小球系膜区为特征[1]。临床主要表现为血尿,部分患者可出现蛋白尿[2]。全球IgAN 约占原发性肾小球疾病的52.66%[3],约30%～40%的IgAN 患者最终会进展为终末期肾病[4]。其发病机制迄今尚不完全明确,亦无特效治疗方案。由于伦理所限,学者们多通过建立IgAN动物模型不断探索此病。动物模型是研究疾病的重要载体,理想的动物模型是研究疾病发病机制或药物疗效的前提。IgAN 动物模型主要包括4 种,即免疫诱导型、自发病变型、继发病变型、糖基化缺陷型。其中免疫诱导型动物模型根据诱导剂种类不同可分为异种蛋白诱导、病原微生物诱导、免疫复合物诱导3 种类型,异种蛋白诱导法所建立的IgAN动物模型由于模型病理改变与人类相似、经济成本低而被国内学者广泛采用。然而,医学界关于此法建立IgAN 动物模型的用药剂量及给药时间的意见尚不统一[5]。目前,国外学者多采用自发病变型IgAN 动物模型,造模成本较高。基于此,本文对异种蛋白诱导法构建IgAN 动物模型展开综述,以期为研究者建立IgAN 动物模型提供参考。

目前国内多采用异种蛋白诱导法构建IgAN 动物模型[6],即口服牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)诱导动物体内产生过量的IgA 分子,沉积于肾小球系膜区诱发IgAN[7]。IgAN 动物模型成功建立主要表现为血尿、肾功能下降等,光镜下显示系膜细胞增生、系膜基质增多,免疫荧光检测可见肾小球系膜区IgA 大量沉积。该模型可用于研究IgAN 的发病机制、治疗方案等。

1 溯源及改良过程

1.1 溯源

IgAN 动物模型由Rifai 等[8]最早建立,国内IgAN 动物模型的建立,最早可追溯至1988 年王丽等[9]使用BSA 口服,建立以轻度系膜增生为特征的肾病模型,造模后小鼠肾出现IgA 荧光强度增强,电镜下电子致密物沉积,系膜基质增生,为该模型的建立奠定了基础。

1.2 异种蛋白诱导建立IgAN 动物模型改良过程

1996 年,刘震等[10]通过对比4 种不同造模方法,提出采用口服BSA+尾静脉注射SEB+皮下注射弗氏佐剂,所建立的大鼠增殖性肾小球肾炎模型病变最典型。该研究通过口服BSA 诱导动物体内产生过量的IgA 分子,沉积于肾小球系膜区诱发IgAN,弗氏佐剂用于增强BSA 免疫原性,加速肾组织病理改变。该模型造模时间短,系膜增生明显,亦因实验时间仅8 周可能影响结果的判定。

聂莉芳等[11]认为,在口服BSA 诱导胃肠粘膜免疫的基础上加以静脉注射BSA 诱导的IgAN 模型更符合人类特征,进一步改进了IgAN 造模方法。具体方法:于第1～6 周按200 mg/kg 隔日口服BSA(以0.1%盐酸酸化水稀释),于第6 周开始隔日1 次按20 mg/kg 尾静脉注射BSA,连续注射3 次,以后仍隔日口服200 mg/kg BSA 到第12 周末。该方法采用口服加尾静脉注射BSA,目的在于增强胃肠粘膜免疫反应。该造模方法易于操作,在12 周末模型出现蛋白尿,病理切片可观察到系膜细胞增生,系膜基质增多,系膜区有IgA、免疫球蛋白G(immunoglobu-lin G,IgG)、补体C3沉积,但数量有限。此模型通过反复给模型鼠灌服0.1%的稀盐酸酸化水,破坏具有碱性环境的肠道粘膜,进而促进免疫球蛋白IgA 抗体的产生,形成大量免疫复合物(immune complex,IC)。此后,宋纯东等[12]、赵刃等[13]皆参考此法成功复制IgAN 动物模型。然而,此模型所引起的血尿与IgAN血尿的发生机制有所差别。

南方医科大学南方医院彭伟等[14]通过对比两种不同的造模方法,A 组口服BSA+静脉注射SEB+注射弗氏佐剂,B 组口服BSA+静脉注射SEB+注射弗氏佐剂+皮下注射CCl4,发现B 组大鼠系膜增生较A 组明显,IgA 分子沉积强度更高。该研究将口服BSA 剂量增加至400 mg/kg,SEB 剂量减少至0.3 mg/kg,增强了免疫原性,降低了毒性,将CCl4由腹腔注射改为皮下注射且剂量减半,减轻了其肝损伤,两组对比证明了B 组血尿、蛋白尿出现更早,模型组肾病理改变更为显著。但由于BSA 剂量仍较低且SEB 毒性较大,该方法所建立的IgAN 动物模型仍不理想。

考虑到SEB 毒性较大,汤颖等[15]进一步改进IgAN 动物模型,联合应用 BSA+脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)+CCl4造模。造模方法:BSA(400 mg/kg,连续6 周隔天灌胃)+LPS(分别于第6、8 周尾静脉注射LPS 0.05 mg)+CCl4(下注射CCl40.1 mL+蓖麻油0.5 mL,每周1 次,持续9 周)。该法以LPS 代替SEB,BSA 剂量较前增加一倍,CCl4给药方法改为皮下注射且减少剂量至诱导肝硬化剂量的1/3。该模型动物成模率高,可重复性强,目前国内研究者复制IgAN 动物模型多沿用此法。然而,该模型在造模时长、药物剂量上仍存在争议。

陆慧瑜等[16]对汤颖等[15]的造模方法进一步改进,具体方案为:持续8 周隔日灌胃BSA 400 mg/kg,每周一次皮下注射蓖麻油0.3 mL+CCl40.1 mL 持续9 周,于第6 周尾静脉注射LPS 0.05 mg。该方案将隔日灌服BSA 的时间由6 周改为8 周,以增强动物免疫原性,尾静脉注射LPS 由2 次改为1 次以减轻LPS累计毒性对模型的损伤,加速模型大鼠肾病变的同时降低死亡率,9 周后成功建立IgAN 动物模型。

为精准把握造模剂量与时长,有学者提出BSA+LPS+CCl4分剂量、时间造模法[17],即将BSA分为高剂量组(600 mg/kg) 和低剂量组(400 mg/kg)隔日灌胃,并在第8 周和12 周观察病理变化。实验发现,造模8 周后,大鼠肾病理出现系膜细胞和系膜基质轻度增生,12 周末更为显著并伴轻度肾间质纤维化,低剂量组病变较轻,12 周末可见免疫荧光,高剂量组荧光表达强于低剂量组。BSA+LPS+CCl4造模法,可在12 周建立病理表现及生化指标趋近人类IgAN 的动物模型,且高剂量BSA(600 mg/kg)模型更为典型。

为解决在不同时间节点、口服不同剂量BSA、BSA 溶剂不同以及在不同节点注射免疫佐剂对建立IgAN 大鼠模型影响有差异这些问题上存在的争议,马思佳等[18]将酸化水作为BSA 溶剂,将BSA 分400 mg/kg 和600 mg/kg 两种剂量对大鼠进行灌胃,分多个时间节点尾静脉注射LPS。该研究通过对比发现,纯化水与酸化水相比作为溶剂效果更加突出,隔日灌服以纯化水溶解的高剂量BSA(600 mg/kg),每周1 次皮下注射CCl4,连续12 周,联合第8、10 周每周1 次尾静脉注射LPS 所建立的IgAN 大鼠模型更接近人类病理。该实验造模成功率高于90%,在操作过程中无大鼠死亡,所提出的造模方法是有待进一步验证。

诸多临床和实验研究表明,肠粘膜免疫系统的激活是IgAN 的重要发病机制,肠-肾轴也参与IgAN的发病[19-22],故有学者提出将异种蛋白加入到饮用水中喂养动物以激活免疫反应[23]。Zou 等[24]将牛丙种球蛋白(bovine gamma globulin,BGG)加入饮用水中喂养动物9 周,12 周后模型出现明显的蛋白尿,肾病理见系膜细胞和系膜基质弥漫性增殖,免疫荧光显示大量IgA 沉积,提示造模成功。通过自由饮水建立动物模型,动物存活率高,实验可重复性强,但无法控制饮水量可能会对模型造成影响,且模型未出现明显血尿。

近年来,随着胸腺肽被广泛应用于各种疾病的辅助治疗中,有学者尝试将胸腺肽应用于建立IgAN动物模型。胸腺作为人体重要的免疫器官,其中存在大量免疫细胞,可分泌抗体。胸腺肽可促进胸腺发育,增强机体免疫,使免疫细胞产生的抗体增多。基于此,高明等[25]对IgAN 动物模型进行改进,造模方法为:持续12 周隔天灌胃BSA 600 mg/kg,每周皮下注射CCl40.1 mL、蓖麻油0.3 mL 及胸腺肽3 mg,分别于第6、8、10 周尾静脉注射LPS 0.05 mg。观察12 周后大鼠均出现蛋白尿,并可见典型病理改变,验证了造模成功。与其他模型相比,该研究首次将胸腺肽用于建模,增强了模型的免疫反应。该模型免疫荧光强度较强,且病理与人IgAN 相似,操作简单,造模成功率高,但大部分模型病理仅呈轻至中度病变,未能出现重度系膜增生、新月体形成等病变,仍需进一步探索。

以上是目前常见的学者们运用异种蛋白诱导法建立IgAN 动物模型的方法,通过异种蛋白诱导造模机制复杂,造模能否成功易受多种因素影响,如动物实验室环境、研究员专业素养、动物自身耐受性、药物等。此外,导致异种蛋白诱导法造模失败还有一个重要原因在于动物本身存在一定的自愈能力。在实验过程中,若已造模成功的动物长时间未再次给予外源性抗原,体内的免疫细胞可能会将原有IC 清除,从而导致造模失败。实验动物的个体差异性也可能导致模型病变程度不一,病理结果有轻有重,不易控制。模型总结见表1。

表1 IgAN 常见动物模型总结Table 1 Summary of common animal models of IgAN

续表1

2 模型间的异同点

总结上述动物模型的异同点,以供读者参考,具体如下:(1)实验动物主要有大鼠、小鼠,其中SD雄性大鼠最为常用。(2)实验动物大致为6～8 周龄。(3)造模时长不等,造模时长最短为8 周,最长造模时长可达12 周。(4)造模方法上均采用异种蛋白诱导法造模,造模均通过口服联合注射药物诱发动物机体免疫反应增强、IC 沉积于肾小球系膜区,具体药物种类、剂量、给药时间各有不同。(5)判断造模成功的方法主要集中在以下方面:①一般情况:体重、毛发、精神、食欲、饮水量、尿量及气味、粪便颜色等;②实验室指标:血常规、尿常规、肝功能、肾功能、24 h 尿蛋白定量、炎症因子、循环IC 等;③肾病理:光镜、免疫荧光、电镜。

3 IgAN 中医研究模型改良思路

IgAN 是以系膜区大量沉积IgA 或IgAIC 为病理特征的原发性肾小球疾病,血尿为其主要临床表现,可兼有蛋白尿、高血压等[26]。在中医古籍中并未记载有IgAN 的病名,但根据其临床表现可归属于“尿血”、“虚劳”、“腰痛”、“肾风”等范畴[27]。其病因无外乎先天禀赋不足与外感病邪两个方面,异种蛋白诱导法造模主要通过影响后天来制备模型。然而目前此法成模评判标准多采用病理评价方法,即以病理作为诊断的金标准,对病证结合模型探索甚少。中医强调辨证论治,同病异治和异病同治的实质是通过逆转证的变化来改变疾病发展趋势,辨证选方治疗可显著提高治疗有效率,大幅度改善模型实验室指标及病理结果[28]。现有的免疫异种蛋白诱导法建立IgAN 动物模型,模型稳定性好,但证候可控性差,无法确保得到实验研究所对应的证型,以此为基础的中药疗效评价说服力有限。

因此,将病因、症状、体征等中医要素与现代医学之客观指标有机统一起来建立病证结合模型是进一步改良IgAN 模型的必然要求。构建病证结合模型要尽可能贴近临床,将疾病造模因素与证候造模因素相结合,充分考虑到环境、体质、饮食、情志等因素对机体的影响,提高造模成功率[29]。同时,要不断完善证候评价体系,探索建立模型动物四诊信息客观化采集方法,以保证模型的稳定性。

4 结语

综上,IgAN 发病机制复杂,其动物模型建立方法尚未完全统一,目前尚无与人类IgAN 临床表现及病理特征完全一致的动物模型。经过学者们的不断探索,提出了多种IgAN 模型的造模方法,方法各有千秋。虽然异种蛋白诱导法建立IgAN 动物模型可操作性及重复性强,但造模过程中易受多种因素影响,且因动物本身有自愈能力而存在诱导失败的可能。此外,现有造模方法评价标准单一,尚无研究者提出病证结合模型。

IgAN 动物模型是研究IgAN 发病机制、诊断、治疗的前提,相信随着现代医学的进步和人们对IgAN病理机制的深入探究,IgAN 实验动物模型会不断革新,愈加符合人类特征。