毛忠文 邓秋芳 李静 王新云 甘金城 骆福秀

心肌缺血再灌注是引起冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)心肌损伤的重要病理机制，其常见于冠心病溶栓等治疗中，有研究表明，在心肌缺血再灌注过程中会产生的大量ROS，是导致再灌注损伤的重要机制[1]。心肌缺血再灌注损伤会导致治疗效益低下，且有多种机制能够参与心肌缺血再灌注损伤，主要包括自噬、内质网应激、血管皮内细胞功能障碍等。自噬是真核细胞中代谢调节的主要机制，能够在缺氧、缺血再灌注等情况下，诱导自噬产生，尤其是在缺血再灌注后会大量产生自噬小体。HIF-1α属于一种转录因子，多存在于线粒体中[2]。硫化氢被认为是一种新型的神经调节因子和信号传递因子，且在多个器官及组织中均有所发现，当机体在病理情况下，其能够发挥抗炎、抗氧化作用且对神经起着保护作用[3]。本文中，建立心肌缺血再灌注损伤大鼠模型，对缺氧诱导因子-1/自噬在心肌缺血再灌注损伤大鼠中的作用，为治疗心肌缺血再灌注损伤提供了新的循证。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究动物：选取SPF级SD健康大鼠40只，由常州卡文斯实验动物有限公司提供，鼠龄(3.8±0.3)个月，体重(229.6±11.8)g。大鼠均养殖在干净笼子里，室温(22.1±1.8)℃，相对湿度35%～40%，每天光照12 h，喂饮纯净水，饲养时间1周。本研究所做实验均获得我院伦理委员会批准。

1.1.2 主要试剂：人抗大鼠LDH抗体(圣克鲁斯生物技术有限公司)；大鼠抗小鼠HIF-1α抗体(上海优宁维生物科技有限公司)；小鼠抗大鼠LC3Ⅰ抗体、人抗大鼠LC3Ⅱ抗体(北京泰泽瑞达科技有限公司)；兔抗大鼠P62抗体(艾美捷科技有限公司)；兔抗小鼠Beclinl-1抗体(上海信裕生物工程有限公司)；SOD ELISA试剂盒、cTnT ELISA试剂盒、CK-MB ELISA试剂盒(上海抚生实业有限公司)；MDA ELISA试剂盒(上海纪宁生物科技有限公司)；T-AOC ELISA试剂盒(上海信裕生物科技有限公司)。

1.2 方法 随机选取40只大鼠中10只作为对照组(C组)，10只作为预处理组(H组)，注射5 μmol/kg的硫化氢于大鼠左侧肾动脉，剩余20只大鼠采用覃琴等[4]诱导建立体内心肌缺血再灌注(I/R)模型，使用50 mg/kg的戊巴比妥钠将大鼠进行麻醉处理，将导管插入右侧颈内静脉以及颈内动脉以便静脉给药和血气分析、血压检测。切开气管后行气管插管，连接呼吸机行呼气末正压通气，恒温控制仪维持大鼠体温36～37℃，行左胸切开术打开心包，在左心耳下缘对冠状动脉左前降支进行结扎，缝线末端套入自制圈套管，静止平衡30 min，使用止血钳阻断冠状动脉左前降支供血，当心外膜发绀苍白则表示缺血模型建立成功，松开圈套管进行灌注，可见心外膜重新充血，表明心肌缺血再灌注(I/R)模型建立成功。后经大鼠左侧肾动脉给予5 μmol/kg的硫化氢，分为HI组，对照组和模型组不作任何处理。所有大鼠给硫化氢1周，静脉采血后处死，以半径为5 cm、转速3 000 r/min离心处理10 min，分离上层血清，-80℃保存，待用。取心脏组织，在4%多聚甲醛进行固定、脱水透明，浸蜡包埋，脱蜡、HE染色，之后脱水、透明，切片厚度4 μm，待封片晾干后显微镜下观察大鼠心脏组织病理学表现。

1.3 观察指标

1.3.1 心电图检测:将针形电极按红、绿、黑分别插入四肢皮下，采用XD-7100单导标准肢体Ⅱ导联记录大鼠造模前后心电图变化。

1.3.2 SOD、MDA水平及T-AOC含量检测:采用比色法对超氧化物歧化酶SOD、丙二醛MDA水平及总抗氧化能力(T-AOC)含量进行检测。

1.3.3 心功能指标:采用二维超声对左心室收缩末期压力(LVESP)、左心室舒张末期压力(LVEDP)进行检测；使用AisualSonic Vevo 2100型彩色超声诊断仪，电子探头，14 mHz，对左心室射血分数(FS)、短轴缩短率(EF)进行检测。

1.3.4 心肌酶水平检测:采用酶联免疫法对肌酸激酶(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌钙蛋白(cTnT)水平进行检测，取50 mmol/L碳酸盐包缓冲液对CK-MB、LDH、cTnT进行稀释，且加入聚苯乙烯的反应孔中，加盖处理后，在4℃下置留24 h，次日洗涤3次后，抛干，在每孔中均加入稀释液(pH值为7.4，0.02 mol/L Tris-HCl缓冲液)稀释待测标本0.1 ml，加入阳性、阴性对照标本，在42℃下置留60 min，将液体移除并洗涤3次后，抛干，在每孔中加入CK-MB、LDH、cTnT抗体0.1 ml，再次置留60 min，将液体移除并洗涤3次，抛干，并在每孔中加入低物液(0.1 mol/L的Na2HPO4,0.05 mol/L的枸橼酸)混匀，且加入0.1 ml邻苯二胺，遮光20 min，再次加入2 mol/L H2SO40.05 ml放置各孔内，终止反应。使用酶标仪检测A450，分析CK-MB、LDH、cTnT水平。

1.3.5 心肌缺血面积、心肌梗死面积、梗死区占心室比比较:再灌注结束后，将前降支重新结扎，采用TTC法对心肌梗死面积进行检测，采用Image Pro-Plus软件分析心肌梗死面积和心肌缺血面积。

1.3.6 HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62蛋白检测:采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)对HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62蛋白进行检测，严格按照定量PCR仪的操作说明书进行。分别加入稀释10倍的PCR缓冲液2.5 μl，MgCl2溶液1.5 μl，上游引物和下游引物0.5 μl，然后加水制成25 μl的反应体系。在94℃环境中反应1 min，55℃环境中反应1 min，72℃环境中反应1 min，循环35次，72℃环境中反应延长5 min，最少重复3次。采用2-△△Ct方法计算出需要检测的HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62表达水平。HIF-1α引物序列：上游:5’-ATGCTTATATCTGGAAGGTATGTGG’；下游：5’-AAAGAGCAAGGGAACGAAAA-3’；LC3Ⅰ引物序列：上游:5’-TCCTGGATAAGACCAAGTTTCTG’；下游：5’-ATAGATGTCAGCGATGGGTGTG-3’；LC3Ⅱ引物序列：上游:5’-GATGTCCGACTTATTCGAGAGC-3’；下游：5’-TTGAGCTGTAAGCGCCTTCTA-3’；P62引物序列：上游:5’-AGCTGCCCTCAGCCCTCTA’；下游：5’-GGCTTCTCTTCCCTCCATGTT-3’；GAPDH引物序列：上游:5’-GATTTGGCATTGTTGAGGG-3’；下游：5’-TGCTATCGCCTATGAAGTCC-3’。

1.3.7 HIF-1α/Autophagy通路蛋白检测:使用Western blot检测3组大鼠HIF-1α/Autophagy信号通路蛋白表达量，提取小鼠肺组织中样品总蛋白，加入5×SDS上样缓冲液，每孔剂量为20 μg。进行电泳，电压为120 V，进行1.5 h后，转至形成PVDF膜，转膜完成后，使用5%的脱脂奶粉进行封闭，室内进行，加入一抗溶液TBST(HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62、Beclinl-1按照1∶2 000稀释)或在温室下孵育12 h。在4℃条件下进行震荡过夜，再次洗涤，放入二抗溶液TBST(HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62、Beclinl-1按照1∶5 000稀释)，室内震荡120 min后，洗涤，显色成像，使用软件分析蛋白条带灰度值。内参蛋白是GAPDH。

2 结果

2.1 病理组织学观察 C组大鼠心肌纤维排列紧密有序，肌段清晰，线粒体丰富；H组大鼠心肌细胞排列整齐，部分细胞水肿；I/R组大鼠心肌纤维排列紊乱，细胞水肿、坏死明显，炎性细胞浸润；HI组大鼠损伤减弱，纤维外观较紊乱，脂肪和空泡变性丰富。见图1。

C组H组I/R组HI组

2.2 4组大鼠心电图ST段变化 缺血前4组大鼠心电图ST段比较，差异无统计学意义(P>0.05)；缺血后I/R组、HI组大鼠心电图ST段高于H组，且HI组大鼠心电图ST段低于I/R组，差异有统计学意义(P<0.05)；再灌注后I/R组、HI组大鼠心电图ST段高于H组，且HI组大鼠心电图ST段低于I/R组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 4组大鼠心电图ST段变化

2.3 4组大鼠心肌组织中SOD、MDA水平以及T-AOC含量比较 H组大鼠心肌组织SOD、T-AOC水平低于C组大鼠，且MDA水平高于C组，但差异无统计学意义(P>0.05)；I/R组、HI组大鼠心肌组织SOD、T-AOC水平均低于C组、H组、且MDA水平高于C组、H组，差异有统计学意义(P<0.05)；HI组大鼠心肌组织SOD、T-AOC水平高于I/R组，且MDA水平低于I/R组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 4组大鼠心肌组织中SOD、MDA水平以及T-AOC含量比较

2.4 4组大鼠心功能指标比较 H组大鼠LVESP、FS、EF低于C组大鼠，且LVEDP高于C组大鼠，但差异无统计学意义(P>0.05)；I/R组、HI组大鼠LVESP、FS、EF低于C组、H组大鼠，且LVEDP高于C组、H组大鼠，差异有统计学意义(P<0.05)；HI组大鼠LVESP、FS、EF高于I/R组，且LVEDP低于I/R组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 4组大鼠心功能指标比较

2.5 4组大鼠心肌酶水平比较 H组大鼠CK-MB、LDH、cTnT水平均高于C组大鼠，但差异无统计学意义(P>0.05)；I/R组、HI组大鼠CK-MB、LDH、cTnT水平均高于C组、H组大鼠，差异有统计学意义(P<0.05)；HI组大鼠CK-MB、LDH、cTnT水平均低于I/R组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 4组大鼠心肌酶水平比较

2.6 4组大鼠心肌缺血面积、心肌梗死面积、梗死区占心室比比较 I/R组、HI组大鼠心肌缺血面积、心肌梗死面积、梗死区占心室比高于C组、H组，差异有统计学意义(P<0.05)；HI组大鼠心肌缺血面积、心肌梗死面积、梗死区占心室比低于I/R组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。

2.7 4组大鼠心脏组织中HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62蛋白表达量比较 H组大鼠心肌组织中HIF-1α、LC3Ⅱ、P62蛋白表达量均高于C组，且LC3Ⅰ低于C组，但差异无统计学意义(P>0.05)；I/R组、HI组大鼠心肌组织中HIF-1α、LC3Ⅱ、P62蛋白表达量均高于H组、C组大鼠，且LC3Ⅰ低于H组、C组大鼠，差异有统计学意义(P<0.05)；HI组大鼠心肌组织中HIF-1α、LC3Ⅱ、P62蛋白表达量均低于I/R组，且LC3Ⅰ高于I/R组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2，表6。

表5 4组大鼠心肌缺血面积、心肌梗死面积、梗死区占心室比比较

图2 4组大鼠HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62荧光定量RT-PCR图

表6 4组大鼠心脏组织中HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62蛋白表达量比较

2.8 4组大鼠HIF-1α/Autophagy通路蛋白表达量比较 H组大鼠心肌组织中HIF-1α、LC3Ⅱ、P62、Beclinl-1蛋白表达量均高于C组，且LC3Ⅰ低于C组，但差异无统计学意义(P>0.05)；I/R组、HI组大鼠心肌组织中HIF-1α、LC3Ⅱ、P62、Beclinl-1蛋白表达量均高于H组、C组大鼠，且LC3Ⅰ低于H组、C组大鼠，差异有统计学意义(P<0.05)；HI组大鼠心肌组织中HIF-1α、LC3Ⅱ、P62、Beclinl-1蛋白表达量均低于I/R组，且LC3Ⅰ高于I/R组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表7，图3。

表7 4组大鼠HIF-1α/Autophagy通路蛋白表达量比较

图3 心肌组织HIF-1α/Autophagy通路蛋白HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62、Beclinl-1蛋白Western blot图

3 讨论

心肌缺血再灌注是由于多种细胞因子和信号通路的参与的复杂病理过程，对心肌缺血再灌注患者的预后和治疗带来了严重的影响[5]。心肌缺血再灌注损伤是指心肌长时间缺血后恢复供血后心肌损伤更加严重的一种病理现象。有研究表明，恢复组织灌注是减少心肌缺血后损伤的最有效办法[6]。但缺血心肌恢复血液再灌注后可能会导致心肌能量代谢障碍、心律失常、心肌细胞超微结构的变化等，进一步加重各方面的损伤，即心肌缺血/再灌注损伤，成为缺血性心肌病治疗的障碍之一，临床治疗应尽量减少甚至避免心肌缺血再灌注所带来的损伤[7,8]。

硫化氢是一种具有臭鸡蛋气味的窒息性气体，外源性硫化氢进入人体将产生细胞毒理性作用，表现为中枢神经系统症状和窒息症状[9]。内源性硫化氢具有多种生理功能，且与多种心血管疾病有关。大鼠心肌I/R损伤模型已被广泛用于心肌I/R损伤实验中。有研究表明，当心肌损伤时，心电图ST段会有明显抬高[10]。本实验发现，再灌注后I/R组、HI组大鼠心电图ST段高于H组，且HI组大鼠心电图ST段低于I/R组，此结果说明，再灌注能够降低大鼠的心电图ST段抬高，有利于心肌I/R损伤大鼠的恢复。自由基蓄积过多会直接导致核酸、蛋白质等物质的过氧化，破坏膜结构，最终导致心肌的不可逆损伤，其主要表现为MDA含量增加以及SDO和T-AOC活力下降；同时还会出现大片的心肌梗死区域，导致心肌组织和结构发现明显的改变[11]。在本文中发现，HI组大鼠心肌组织SOD、T-AOC水平及心肌梗死面积高于I/R组，且MDA水平低于I/R组，此结果可得，硫化氢能够降低大鼠心肌损伤程度，减少心肌梗死范围，保护心功能。与杜靖等[12]研究结果一致。

HIF-1α是一种核转录因子，其主要存在于线粒体中，能够抑制电子产物ROS的产生，还能够通过Beclinl-1/Bcl-2途径促进线粒体的自噬[13]。HIF-1α的表达主要受其浓度的调节，是HIF-1发挥的重要亚基，在常氧条件下能够别快速溶解，且在低氧状态下降解受阻，表达增加，并能够通过调控其下游蛋白发挥作用[14]。自噬被认为在MIRI中发挥重要作用，在正常生理状态下，其在心肌细胞中低量存在，当机体处于缺氧、缺血等状态下，其水平会显著增加。自噬会促进细胞内重要功能的胞质蛋白和细胞器降解，从而为细胞的生存代谢过程中提供营养[15]。高鲁方等[16]研究表明，心肌缺血再灌注损伤过程中自噬起重要作用，小剂量衣霉素诱导ERS预处理可在缺血期引起适度的细胞自噬，有助于维持心肌细胞的内稳态，产生一定程度的心肌保护效果。LC3主要分为Ⅰ型和Ⅱ型，正常情况下，细胞内合成的LC3经过加工形成Ⅰ型，则呈常规表达；当自噬发生后，LC3Ⅰ的表达急剧下降，LC3Ⅱ表达显著升高，因此，通过LC3Ⅰ、LC3Ⅱ的比值，可以检测细胞自噬水平[17]。P62是一种泛素结合蛋白，且与蛋白质的泛素化密切相关，其能够参与多种细胞自噬及调控过程[18]。自噬中，其能够与蛋白质泛素相结合，与自噬小体内膜LC3Ⅱ形成复合物，并被自噬溶酶体一同降解。Beclinl-1是自噬调控的关键蛋白之一，能够参与自噬体膜的形成，诱导自噬发生[19,20]。因此在本文中对4组大鼠心肌组织中HIF-1α、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、P62、Beclinl-1蛋白进行检测，结果显示，HI组大鼠心肌组织中HIF-1α、LC3Ⅱ、P62、Beclinl-1蛋白表达量均低于I/R组，且LC3Ⅰ高于I/R组，此结果说明，硫化氢可有效改善心肌缺血再灌注大鼠心肌组织中HIF-1α、LC3Ⅱ、P62、Beclinl-1蛋白表达量，效果显著。

综上所述，硫化氢对大鼠心肌缺血再灌注损伤有保护作用，能够缩小心肌梗死面积，其作用机制可能与HIF-1α/Autophagy通路有关，抑制再灌注期自噬的表达，从而减轻心肌缺血再灌注损伤。