李冰冰 王嵬 支运霞 李发余 王士雨 程国良 臧恒昌

人参固本口服液，由人参、地黄、熟地黄、山茱萸、山药、牡丹皮、泽泻、茯苓、天冬、麦冬等十味中药组成，药性温和，具有滋阴益气、固本培元的功效。药理学研究未发现其毒性，具有抗疲劳、耐缺氧提高机体免疫力、清除自由基和抗脂质过氧化等作用[1,2]，临床可用于肺肾阴虚气弱咳嗽、肾病综合征、中医辨证气阴虚的慢性支气管炎、慢性肾炎、白细胞减少症和辅助治疗证属气阴虚的肺结核等[1,3,4]。此方由六味地黄丸加味而成，方中六味地黄丸滋补肝肾、养阴清热，天冬、麦冬生津增液、润肺止咳，人参大补元气，诸药配合，滋阴补气。同时，除茯苓外的9种中药均是可用于保健食品的中药，人参、山茱萸、茯苓、山药又为“药食同源”类中药。《黄帝内经》中就有了食疗对疾病的去除和预防作用[5]。因此人参固本口服液对阴虚气虚患者均具有补益作用，普通人服用后也具有一定的提高机体免疫功能的作用。网络药理学作为药物研究的新模式，对中药/复方物质基础、作用机制研究的发展起到了重要的作用[6]。本文通过网络药理学筛选出人参固本口服液活性成分、作用靶点，并进行聚类分析，通过靶点、通路的分析，预测其药理作用及作用机制，为人参固本口服液临床应用提供理论参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 从《中国药典》(2015年版)查询人参固本口服液中10味中药的归经，借助中药系统药理分析平台(TCMSP，http://tcmspw.com/tcmsp.php)[7]，检索各中药的化学成分；以BATMAN-TCM数据库[8]和已发表文献作为补充。结合口服生物利用度(OB≥30%)和类药性(DL≥0.18)，收集化学成分及相应靶点，根据Unitprot数据库[9](http://www.Unitprot.org/)更正所有靶点的名称，最终建立人参固本口服液的成分库和靶点库。

1.2 成分-靶点网络、蛋白互作网络的构建 利用Cytoscape软件构建人参固本口服液的中药-成分-靶点网络[10]。将人参固本口服液的靶点信息导入String数据库，设定物种为“Homo snpiens”，获取全部蛋白-蛋白相互作用(PPI)网络。

1.3 Hub网络的提取 通过Cytoscape软件中的Tools模块，NetworkAnalyzer-Network Analysis-Analyze Network进行网络分析获取相关拓扑参数，首先选取节点Degree值的2倍中位数为筛选标准，其次以Betweenness centrality值、Closeness centrality值和neighborhood connectivity值的中位数作为筛选依据，提取出相应的Hub网络。

1.4 生物通路富集分析 为了进一步了解上述筛选出的靶标基因的功能，将这些靶点导入Metascape数据库[11](https://david.ncifcrf.gov/)，进行GO(gene ontology)生物学过程(Biological Process，BP)、细胞组成(Cellular Component，CC)、分子功能(Molecular Function，MF)富集分析和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)信号通路富集分析，并利用R 4.0.2软件将其结果可视化。

1.5 分子对接 从TCMSP或ZINC数据库[12](http://zinc.docking.org/)获得Degree值前10成分的mol2格式文件，用Autodock Tool软件处理后得到pdbqt格式文件。从PDB数据库[13](https://www.rcsb.org/)下载关键靶蛋白的3D结构，运用Pymol软件处理后得到pdbqt格式文件。用Autodock vina将成分和蛋白对接[14]。结合能≤-5.0 kJ/mol作为筛选标准，结合能数值越小，对接结果较好[15]。

2 结果

2.1 人参固本口服液活性成分 检索人参固本口服液各中药的化学成分，并以OB≥30%、DL≥0.18为筛选条件，最终得到61个成分。见表1。

表1 人参固本口服液活性成分基本信息(OB前20位)

2.2 中药-成分-靶点相互作用网络 人参固本口服液中药-成分-靶点网络共包括294个节点(10个中药节点、61个成分节点、223个靶点节点)和761条边，“△”代表中药，“〇”代表成分，“◇”代表靶点，每条边则表示中药成分及成分与靶点相互作用关系(见图2)。按照Degree值，排名前10位的成分分别是quercetin(槲皮素)、kaempferol(山奈酚)、7-Methoxy-2-methyl isoflavone(7-甲氧基-2-甲基异黄酮)、β-sitosterol(β-谷甾醇)、stigmasterol(豆甾醇)、fumarine(原阿片碱)、tetrahydroalstonine(四氢鸡骨常山碱)、kadsurenone(海风藤酮)、hederagenin(常春藤素)、hancinone C(山蒟酮C)。见图1。

图1 人参固本口服液中药-成分-靶点网络

2.3 中药-归经网络 根据人参固本口服液各味药的归经信息，构建该方的中药-归经网络。图中黄色“□”节点代表中药，绿色“○”节点表示归经，绿色节点越大、颜色越深表明所属归经的中药数目越多。网络中五脏(肾、肺、心、肝、脾)的Degree值分别为9、5、5、4、3，其中，处方中仅麦冬归经不包含肾经。归经分析可见，人参固本口服液组方药性温和，对机体的整体调节大有裨益。见图2。

图2 人参固本口服液中药-归经网络

2.4 PPI及Hub网络构建 将223个人参固本口服液的作用靶点导入String数据库，用Cytoscape软件可视化，形成219个节点、3 937条边的靶点的PPI网络；根据网络的拓扑学性质筛选Degree值、Betweenness centrality值、Closeness centrality值较大的节点进行分析，得到含有48个核心靶点的Hub网络。按照Degree值从高到低，Hub网络中共有11个靶点与其他47个靶点均有相互作用(即Degree值=47)，这些靶点分别为：AKT1、CASP3、CXCL8、EGF、IL6、MAPK1、MMP9、PTGS2、TNF、TP53、VEGFA。见图3。

图3 人参固本口服液的PPI网络(A)及Hub网络(B)

2.5 GO功能分析和KEGG通路分析 通过Metascape数据库进行的GO功能富集分析得到GO条目1411个(P<0.01)，其中BP条目1 347个，CC条目13个，MF条目51个，各类别分析中排名前20位的条目(CC 13个)。其中，BP主要涉及免疫调节、代谢过程、细胞功能调节、信号、应激反应等生物过程，CC主要包括膜区域、膜筏、膜微结构域等，MF主要包括转录因子结合、酶结合、细胞因子受体结合等。KEGG通路富集分析筛选得到126条(P<0.01)信号通路，与癌症相关的疾病通路有25条，免疫相关的疾病通路有12条，心血管及血液系统相关的疾病通路有14条，与寄生虫、真菌、病毒感染引起的疾病通路有18条，血糖调节的通路有9条，信号通路共38条。选Count值较大的前20条通路进行可视化。见图4、5。

图4 人参固本口服液作用靶点GO分析

图5 人参固本口服液核心靶点KEGG富集分析的前20条通路气泡图

2.6 分子对接结果分析 将人参固本口服液中排序前10的核心成分分别与Hub网络中的11个靶点进行分子对接。一般认为配体与受体结合的构象稳定时能量越低，发生的作用可能性越大，结合能≤-5.0 kJ/mol作为筛选标准，结合能≤-20.93 kJ/mol时则视为成分与靶点有较好的活性，结合能≤-29.34 kJ/mol时则结合活性强烈[15]。分子对接结果，图中“〇”越大、颜色越深，表示成分与靶点的结合活性越强。所有对接结果均≤-20.93 kJ/mol，约60%的对接结果≤-29.34 kJ/mol。对接效果最好的靶点包括：AKT1、PTGS2、CXCL8、TNF、CASP3，对接效果最好的成分包括：fumarine、tetrahydroalstonine、β-sitosterol、stigmasterol、kaempferol。对其中的4个不同类型成分进行分析：β-sitosterol(甾体)、fumarine(生物碱)、7-Methoxy-2-methyl isoflavone(黄酮)、hancinone C(木脂素)与AKT1(PDB ID：6S9W)的对接位置与原有配体类似，均落入蛋白残基形成的活性口袋中，结合能分别为-46.47、-43.54、-41.45和-36.01 kJ/mol。β-sitosterol羟基进入AKT1口袋内侧，与氨基酸残基(Ser205和Thr211)形成氢键，fumarine与AKT1的氨基酸残基(Asn54和Asp274)形成氢键，与ARG273形成π-cation作用，7-Methoxy-2-methyl isoflavone与AKT1的氨基酸残基(Trp80)形成π-π堆积，hancinone C与AKT1的氨基酸残基(Asn53和Arg200)形成氢键。见图6、7。

3 讨论

人参固本口服液组方是由六味地黄丸、二黄丸化裁而成。六味地黄丸，肾肝脾三阴并补，以补肾阴为主。现代药理学研究表明，六味地黄丸具有调节免疫、抗肿瘤、降血糖血脂等作用[16]。天冬补脾生水，地黄补肾养阴，人参补脾益气，三药并称“三才”，是调治补益常用的基础方[17]。二黄丸，出自《寿亲养老新书》[18]，由“三才”加熟地黄、麦冬组成，益气养阴，使气血旺盛，多用于治疗心肺肾气阴两虚，具有延缓衰老的作用[19]。人参固本口服液，药性温和，气阴同补，对机体的整体调节大有裨益。

图6 活性成分与AKT1相互作用分析(A：β-sitosterol，B：fumarine，C：7-Methoxy-2-methyl isoflavone，D：hancinone C)

图7 分子对接结果气泡图

本研究运用网络药理学方法，从人参固本口服液中得到61个有效成分，包括烯烃类、生物碱类、黄酮类、萜类、甾体类、木脂素类、糖苷类等，Degree值最高的5个成分为槲皮素、山奈酚、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、β-谷甾醇、豆甾醇。组方归经分析发现，人参固本口服液包含“五脏”归经，以肾经为主，体现了补虚的遣方用药特点[20]。从所有靶点的PPI网络中得到48个核心靶点的Hub网络，Hub网络中有11个靶点的Degree值为47，这些靶点分别为：AKT1、CASP3、CXCL8、EGF、IL6、MAPK1、MMP9、PTGS2、TNF、TP53、VEGFA。对48核心靶点进行KEGG信号通路富集分析结果可知，涉及与癌症相关的疾病通路有25条，免疫相关的疾病通路有12条，心血管及血液系统相关的疾病通路有14条，与寄生虫、真菌、病毒感染引起的疾病通路有18条，调节血糖的通路9条，信号通路共38条。癌症相关的疾病通路包括：胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、子宫内膜癌、结肠直肠癌、胶质瘤、非小细胞肺癌、黑素瘤、慢性骨髓白血病、小细胞肺癌、甲状腺癌、肾脏上皮肾细胞癌等。

AKT1是癌症中最频繁激活的增殖和存活途径的核心成员[21]，AKT1抑制剂能诱导肝癌细胞自噬死亡[22]，活化的AKT1可以抑制细胞凋亡，促进细胞周期运行及细胞侵袭和转移[23]。PTGS2是前列腺素生物合成的一个重要限速酶，正常组织中几乎不表达，在多种恶心肿瘤中高度表达[24]。CASP3是细胞凋亡的主要执行者，通过特异性地裂解一系列底物而导致细胞凋亡。IL-6和TNF参与了慢性病贫血/缺铁性贫血的发生发展[25]。TP53在癌症治疗方面有广泛的研究[26,27]，参与了多种细胞死亡通路，且可作为信号中心评估神经元损伤情况[28]。利用分子对接技术对主要活性成分和核心靶点的相互作用进行模拟，发现人参固本口服液的主要活性成分与关键靶点均具有强烈的结合能力，所有对接结合能均≤-20.93 kJ/mol，约60%的对接≤-29.34 kJ/mol。氢键、疏水作用、π-cation作用和π-π堆积可能是主要的结合形式。

人参固本口服液源于中医经典方，肺肾同补，气阴同调，既能治已病，还可治未病。“扶正固本”是中医药治疗肿瘤的重要指导思想。人参固本口服液不仅能减轻癌症患者化疗过程中白细胞减少症[1]，还能调节机体免疫力，起到固本培元的作用。通过网络药理学预测和分子对接技术，从分子水平阐述了人参固本口服液通过多成分、多靶点、多通路发挥功效的整体调节，为人参固本口服液的临床用药和再开发提供重要理论依据。