栾艳超 韩青松 刘佳坤 马静

肺癌作为危害人类健康最常见的恶性肿瘤，近年来发病率呈快速上升的趋势，肺癌是目前全球患病率和死亡率均排第1位的肺部恶性肿瘤性疾病，值得注意的是，我国已经成为全球肺癌发病率最高的地区[1]。肺腺癌是最常见的肺癌亚型，也是非吸烟肺癌患者中最常见的肺癌组织学类型[2]。预计2018年全球将有新发肺癌病例210万，新发死亡病例180万，死亡人数占癌症总体死亡人数的18.4%[3]。尽管近些年来由于靶向治疗等新的治疗方式的飞速发展使得肺癌的治疗取得重大进展，但是由于约70%的患者在诊断为肺癌时就已经出现远处转移或为局部晚期[4]。因此，继续深入研究新的肺癌治疗靶标和预后生物标志物显得尤为迫切。CHD5基因(染色质解旋酶DNA结合蛋白5) 定位于人染色体1p36(1号染色体短臂3区6带)上，最新的研究表明，在恶性肿瘤细胞调控中的抑癌基因作用已引起广泛关注[5]。Bagchi等[6]对小鼠模型的研究证实CHD5基因通过p19Ar/p53通路发挥作用，具有调控细胞过度增殖、分化障碍或凋亡抑制，参与肿瘤的发生和发展。动物实验也表明多种肿瘤组织基因组1p36片段常伴有缺失[7,8]，且越来越多的研究表明，CHD5因在肿瘤组织中表达下调，从而加速肿瘤进展[9,10]。而随后的功能性研究也提示CHD5是位于1p36的基因片段内的一个强有力的肿瘤抑制因子，且在多种恶性肿瘤中异常表达与肿瘤的发生、侵袭转移和预后密切相关；然而，有关CHD5与肺腺癌关系的研究还少有报道。基于以上研究背景，本研究旨在通过检测LUAD组织中CHD5表达情况，并结合患者临床病理特征和预后资料分析其与预后的关系，以期为寻找肺腺癌临床生物靶点的开发提供理论依据，报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2013年1月至2014年12月在我科进行手术切除的肺腺癌患者组织标本130例。选取标准：所有入组患者为术前未接受抗肿瘤治疗的初诊患者，且均排除既往恶性肿瘤病史。所有患者随访截止时间2019年12月，且均已经签署知情同意书，并通过我院伦理委员会审核、批准。130例纳入研究的患者中，男63例，女67例；年龄45～81岁，平均年龄(60.4±9.2)岁；其中≥60岁74例，<60岁56例；肿瘤直径<3 cm 70例，≥3 cm 60例；淋巴结转移69例，无淋巴结转移61例；存在远处转移9例，不存在远处转移121例；未接受术后治疗54例；而接收术后治疗76例(其中接受单纯化疗46例，接收单纯放疗5例，接收单纯靶向治疗10例；同时接受放化疗10例，同时接受放化疗和靶向治疗2例，同时接受化疗和靶向治疗2例，同时接受放疗和靶向治疗1例)。

1.2 试剂 Trizol试剂购自USA Invitrogen，逆转录试剂盒(High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor),实时定量PCR( qPCR) 试剂盒上海Promega公司，AGAP2-AS1购自美国CST公司,内参GAPDH 引物购自上海生工生物工程有限公司。

1.3 总RNA提取和qPCR 向100 mg 组织中加入1 ml TRIzol，离心后用氯仿异丙醇提取RNA，DEPC 水重悬后经3∶1苯酚/氯仿萃取和乙醇纯化，取1 μg 总RNA 采用High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor 合成cDNA，使用SYBR Premix ExTaq 试剂盒内试剂按操作说明进行实时荧光定量PCR方法检测CHD5的表达量，并以GAPDH为内参基因，通过2-△△Ct法计算倍数变化。实时荧光定量PCR所用的CHD5上游引物为：5’-F-GCCCGTGAGCCTTCCTAAG-3’，下游引物为：5’-GGGGAGTAGTCACTGCCTTC-3’。GAPDH的上游为：5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’，下游引物为5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’。并通过Cutoff Finder[11]筛选出CHD5表达水平的最佳分界值,该程序可基于对数秩检验(Log-rank test)计算最佳分界值。

1.4 随访 通过常规门诊复查、电话回访等形式随访，随访截止时间为2019年12月。随访内容及记录情况包括：病情、病史询问、专科查体、肿瘤标志物检验、胸部CT检查等。患者术后的治疗方案、复发及死亡等。

2 结果

2.1 CHD5在LUAD组织中的表达情况 qRT-qPCR结果显示，与癌旁组织相比，130例LUAD组织中CHD5表达水平显著降低 (P<0.001)。见表1。

表1 LUAD与癌旁组织CHD5表达情况

2.2 CHD5表达与LUAD患者的临床病理特征关系 以130例癌组织中CHD5表达的中位数作为分界点，将患者分为高表达组65例和低表达组65例，两组相比存在显著差异(P<0.01)。进一步分析CHD5表达与LUAD临床病理特征的关系，结果显示CHD5表达与临床分期、淋巴结转移、远处转移和术后治疗显著相关(P<0.05)，与年龄、性别、吸烟和肿瘤直径无关。见表2、3。

表2 LUAD组织中CHD5高表达组与低表达组表达情况

表3 130例LUAD组织中CHD5的表达与临床病理特征关系 例

2.3 CHD5的表达水平与LUAD患者预后的关系 至随访截止日期，生存分析结果显示， CHD5高表达患者的中位DFS为49.8个月，长于65例低表达患者的30.9个月(P<0.01)，其中临床分期(Ⅲ～Ⅳ期)、肿瘤直径(≥3 cm)、有淋巴结转移、未术后治疗的患者预后较差(P<0.01)。见表4。

表4 130例LUAD患者的DFS情况

2.4 LUAD患者DFS的单因素和多因素分析 单因素生存分析结果显示，临床分期、肿瘤直径、淋巴结转移、远处转移、术后治疗和CHD5表达水平与LUAD患者的DFS有关(P<0. 01)；进一步将上述因素纳入多因素Cox比例风险回归模型，结果显示，术后治疗(HR=0.290，95%CI：0.129～0.652)和CHD5表达水平(HR=0.181，95%CI：0.073～0.447)为影响DFS的独立因素(P<0. 01)。见表5，图1、2。

表5 LUAD患者DFS的单因素和多因素Cox比例风险模型分析

图1 肺腺癌患者总生存的单因素Cox比例风险模型分析

3 讨论

最新的研究发现，肺癌已发展成为全球发病和死亡率最高的恶性肿瘤之一，因其局部侵袭、远处转移及耐药等原因，每年因肺癌死亡的患者约占所有癌症死亡患者总数的1/5，居癌症之首[12]。肺癌相关基因的研究一直是全世界关注的热点，然而，肺癌的发生和发展机制并未完全阐明。据报道生存时间超过5年的患者仅有13%，且其死亡率与发病率的比值为0.87[13]。因此，众多研究人员希望通过肺癌的发病机制出发，不仅寻找新的微创的生物标志物来提高早期诊断的准确性，研制出新的化疗药物及分子靶向药物，还可以减少不必要的创伤性的诊疗并改善预后。

图2 肺腺癌患者总生存的多因素Cox比例风险模型分析

随着分子生物学飞速发展，越来越多的研究表明，肺癌的形成是一个常伴有多种基因功能失常的过程，包括抑癌基因的灭活和原癌基因的激活等，并促进肿瘤恶性化，进一步增强了癌细胞的迁移和侵袭能力[14]。研究发现，当恶性肿瘤组织内CHD5缺失或是表达下降时，导致抑制肿瘤细胞发展、发生的调控系统出现功能降低，进一步提示CHD5为抑癌基因[15]。Brodeur等[16]通过对神经母细胞瘤组织及其相应细胞系中CHD5基因表达水平的检测，发现CHD5表达水平较正常组织均显著降低，且神经母细胞瘤患者的临床及预后与CHD5表达水平也显著相关。最近研究发现CHD5基因突变也存在于成神经细胞瘤、乳腺癌中[17,18]。而在LUAD组织中的表达情况少有报道。

在本研究中，通过RT-PCR检测我院130例肺腺癌组织中CHD5的表达情况；同时借助Cutoff Finder程序将130例LUAD患者分为70例高表达组和60例低表达组，结果显示，2组间比较有显著的统计学差异，且CHD5低表达的患者预后较差。统计学分析进一步证实CHD5表达与LUAD组织的肿瘤大小、淋巴结转移、远处转移和术后治疗显著相关，这也提示CHD5基因很可能成为肺腺癌的一个潜在的抑癌基因提供了有力证据。此外本研究通过单因素Cox比例风险模型分析发现，肿瘤大小(P<0.01)、肿瘤分期(P<0.01)、淋巴结转移(P<0.01)、肿瘤的远处转移(P<0.01)和术后治疗(P<0.01)和CHD5表达水平(P<0.01)与患者的总生存相关。进一步通过多因素Cox比例风险模型分析，发现肿瘤分期(P<0.01)、术后治疗(P<0.01)和CHD5表达量(P<0.01)是影响患者总生存的独立预测因，进一步提示其可能是LUAD预后不良的因素。同时，Kaplan-Meier生存分析发现CHD5表达水平与LUAD患者的总生存期呈正相关(P<0.01)，提示CHD5在LUAD中可能发挥着抑癌基因的作用。但是，CHD5在LUAD中具体的机制及生物学功能尚不清楚，亟需进一步阐明。如果CHD5的生物学作用能在体内外实验中得到进一步验证，那么其将有助于LUAD的检测与治疗。本研究由于是回顾性分析，且样本量较小(130例)，无法充分控制混杂因素的影响，尚不足以指导临床实践，但却为后续的临床和基础研究提供了有意义的参考。

综上所述，CHD5表达量与LUAD的肿瘤分期、术后治疗和预后显著相关，可能是LUAD诊断与预后的标志物，为靶向治疗肿瘤提供重要参考价值。同时我们的研究提示，CHD5低表达组患者的总生存显著低于CHD5高表达组患者，因此，是否可以通过上调CHD5表达来抑制LUAD细胞的增殖与侵袭将是我们进一步研究的课题。