李永华 鹿树军

1 滨州医学院 山东 烟台 264003； 2 滨州医学院附属医院神经内科 山东 滨州 256603

卒中后认知障碍(post-stroke cognitive impairment，PSCI)是除阿尔茨海默病外的最常见的痴呆类型，脑卒中发生后大脑血管病变导致记忆和认知功能的逐渐衰退。在老年人群中，PSCI的患病率约为5%，年龄每增加5.3岁，患病率增加1倍[1-3]。PSCI患者存在不同程度的认知功能损害，部分或完全需要他人照顾，给家庭、社会造成沉重的经济和精神负担。目前的治疗手段主要包括治疗原发性脑血管疾病和脑功能恢复，然而治疗效果均欠佳。PSCI主要是由遗传—环境因素共同作用引起，肠道微生物可能是被忽略的一个重要的环境危险因素[4-5]。动脉粥样硬化、脑血管病变、神经炎症、代谢综合征等是脑卒中的常见病因及发病机制，而肠道菌群与这些因素紧密相关[6-8]。本研究通过分析中国山东某地PSCI患者肠道菌群的组成特点，分析肠道菌群与PSCI的相关性，从而为肠菌影响PSCI的发生发展及粪菌移植治疗PSCI提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 纳入2020年7月—2021年7月在高密市人民医院诊断为PSCI患者29例，卒中组患者18例，对照组20例。参与者是从高密市人民医院收治患者中招募的。其中，PSCI组纳入标准为：符合PSCI的诊断标准；影像学显示有明确的梗死病灶；汉密尔顿抑郁量表(HAMD)评分<10分；患者或患者家属知情同意，志愿参与并签署知情同意书。卒中组纳入标准为：符合2018年AHA/ASA急性缺血性脑卒中患者的早期治疗指南；首次发病，有神经系统定位体征，头颅CT或MRI显示有梗死病灶；无相应认知障碍症状，且HAMD评分≥10分。对照组为为我院同期查体健康者，无急性缺血性脑卒中临床表现，经头颅CT或MRI除外梗死病灶。排除标准为：3个月内使用益生菌或抗生素；炎症性肠病、消化道恶性肿瘤、消化道手术病史等疾病；引起认知障碍的其他神经精神疾病，如脑外伤、帕金森病、癫痫、精神分裂症等；合并严重原发疾病，如心脏衰竭、肾衰竭、肝癌等。

1.2 资料收集与认知功能评估 收集患者性别、年龄、既往史等基础资料，由经过培训的专业人员通过MMSE、MoCA进行评估测定。MMSE评分参考的痴呆严重程度分级为：轻度≥21分；中度10～20分；重度≤9分。 MoCA评分参考≥26分为正常。

1.3 粪便标本的采集 将其粪便标本保存至已消毒的大便杯子，于1 h内置于-80°C冰箱保存用于后续检测，避免反复冻融。

1.4 粪便样本DNA的提取 采用强力粪便DNA提取试剂盒法进行。从-80℃冰箱取出粪便样品，提取0.15 g左右到Dry Bead Tube中，60℃水浴直至全部溶解，65℃水浴加热10 min、13 000 g离心1 min。依次加入250 μL C2、C3、C4、C5、C6溶液。用Epoch分光光度计检测DNA浓度及纯度，美吉生物医药科技有限公司进行Illumina Miseq测序。

1.5 粪便DNA的16s rRNA V3-V4的扩增及测序 PCR扩增，按指定测序区域，合成带有barcode的特异引物。16s rRNA V3-V4区引物(338F-806R)鉴定细菌的多样性。其中，引物序列为：338F ACTCCTACGGGAGGCAGCA 806R GGACTACHVGGGTWTCTAAT。

1.6 生物信息学分析

1.6.1 数据质控 MiSeq测序得到双端序列数据，首先依据PE reads之间的overlap关系，将成对的reads拼接成1条序列，同时对reads的质量和拼接的效果进行质控和过滤，根据序列首尾两端的barcode及引物序列来区分样品从而得到有效序列，接着对序列方向进行校正，即为优化数据。使用软件为FLASH和Trimmomatic。

1.6.2 物种注释与评估 运算分类单位(operational taxonomic units,OTU)是通过聚类操作，把序列根据彼此的相似性归类为许多小组，1个小组就是1个OTU。一般在97%相似水平下的OTU进行生物信息统计分析。采用RDP classifier贝叶斯算法对OTU代表序列进行分类学分析。

1.6.3 Alpha多样性分析 反映群落丰富度(community richness)的指数有sobs、Chao、Ace。反映群落多样性(community diversity)的指数有Shannon、Simpson、Coverage。本研究选择Ace及Shannon进行研究。组间Alpha多样性指数差异检验应用方差分析法，检测不同分组间的指数值是否具有显著性差异。

1.6.4 物种Venn图分析 Venn图可用于统计多组或多个样本中所共有和独有的物种(如OTU)数目，可以比较直观地表现环境样本的物种(如OTU)数目组成相似性及重叠情况。在通常情况下，选用相似水平为97%的OTU或其他分类学水平的样本表。

1.6.5 群落组成分析 根据分类学分析结果可以了解不同分组(或样本)在各分类水平(如域、界、门、纲、目、科、属、种、OTU等)上的群落结构组成情况。本研究在门和属的水平上比较各组的群落组成情况。

2 结果

2.1 一般资料的比较 PSCI组MMSE、MoCA评分水平低于对照组(P<0.01)，而在年龄、性别、高血压病史、糖尿病史、吸烟史、饮酒史、血糖水平、高脂血症史，各组比较，差异无统计学意义(表1)。

2.2 肠道菌群Alpha多样性分析 Alpha多样性是对单样本中物种多样性的分析，反映了微生物群落的丰度和多样性。图1显示，对照组较PSCI组微生物群落(肠道菌群)更多样化。与卒中组相比，PSCI组的Shannon指数值升高(t=0.11，P<0.05)，且Ace指数值升高(t=42.0，P<0.01)；与对照组相比，PSCI组的Shannon指数值升高(t=3.9，P<0.05)，且Ace指数值升高(t=21.4，P<0.01)。

表1 3组一般资料的比较

两两比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 物种Venn图分析 图2显示，3组有533个共有OTU，即3组样品具有较高的相似性，PSCI组有35个特有OTU，卒中组有45个特有OTU，对照组有38个特有OTU，提示3组分布存在差异性。

图2 肠道菌群的物种Venn图分析

2.4 物种差异分析 本研究应用Kruskal-Wallis H分析法比较3组间的菌群物种差异。图3显示，PSCI 组与卒中组、对照组的肠道菌群结构具有明显的不同。PSCI组中多种条件致病菌(例如Faecalibacterium/粪杆菌属、Bacteroides/拟杆菌属拟杆菌，Pseudomonas/假单胞菌属等)明显増加(P<0.05)，而Ruminococcus/瘤胃球菌属等有益菌群明显减少(P<0.05)。

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3 讨论

PSCI是指由脑血管病的高危因素(高血压病、糖尿病、高脂血症和高同型半胱氨酸血症等)、显性脑血管病(脑梗死和脑出血等)及非显性脑血管病(白质疏松和慢性脑缺血等)引起的一组从轻度认知损害到痴呆的临床综合征，其病因和发病机制尚未明确[9-10]。近年来随着对肠道微生物认识的深入，肠道菌群作为重要的环境因素在调节代谢性疾病的发生中的作用已被熟知。肠菌与糖尿病、动脉粥样硬化等PSCI危险因素的致病机制关系密切。然而，PSCI与肠道菌群的直接相关性尚未有相关研究涉及。

肠菌的Alpha多样性分析表明PSCI组的Ace指数值和Shannon指数值均小于对照组。无症状性动脉粥样硬化患者的肠道菌群与对照组相似[11]，而本研究也发现存在这种现象，这可能是与3组间的肠菌结构相似有关，但是需要扩大样本量进一步去除混杂因素。

3组有533个共有OTU，即3组样品具有较高的相似性，PSCI组有35个特有OTU，卒中组有45个特有OTU，对照组有38个特有OTU。这些结果表明，PSCI患者肠道菌群的分布与非PSCI人群存在差异性。本研究分析群落组成发现，PSCI组中多种条件致病菌(例如Faecalibacterium/粪杆菌属、Bacteroides/拟杆菌属拟杆菌，Pseudomonas/假单胞菌属等)明显増加，而有益菌(Ruminococcus/瘤胃球菌属)降低。Bacteroides/拟杆菌属拟杆菌属于变形菌门，变形菌门的高丰度是潜在的菌群紊乱和疾病风险的识别标记[12]。百岁老人中血浆促炎细胞因子的高水平与肠道菌群中变形杆菌的富集及几种产丁酸菌的减少相关，而高龄是PSCI的一个主要危险因素[13-14]。Burton等[15]对比多发性硬化患者与健康家庭成员/双胞胎的粪便菌群发现，Acinetobacter calcoaceticus(乙酸钙不动杆菌)在多发性硬化患者中增加，模型小鼠的研究亦验证了该发现，这可能与刺激IL-10表达诱导促炎反应相关。Ruminococcus/瘤胃球菌属是主要的纤维降解菌，其产生的短链脂肪酸对于宿主的营养和健康有重要意义[16]。

综上所述，本研究通过16s rRNA测序及相关生物信息学分析对肠道菌群进行预测，发现PSCI患者具有独特的菌群结构特点，这为肠菌影响PSCI的发生发展及粪菌移植治疗PSCI提供理论依据。