赵梅娥 张 慧 甄宏斌 黄焕源 王春霞 谢小冬（兰州市第一人民医院，兰州 730000）

乙型病毒性肝炎（viral hepatitis type B）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染引起的以肝脏炎症性病变为主的传染病，可引起多器官损害，在世界范围内广泛流行。世界卫生组织全球病毒性肝炎报告显示，2015年全球范围内约2.57亿人患有慢性HBV感染，约134万人因乙型病毒性肝炎死亡，且死亡人数逐年增加［1］。预防乙肝病毒感染传统且有效的策略是接种乙肝疫苗，但健康人群按0、1、6个月常规接种程序接种三剂乙肝疫苗，仍有5%～10%接种者未产生乙肝病毒表面抗体（hepatitis B surface antibody，抗-HBs）或产生的抗-HBs滴度＜10 U/L而呈无应答状态［2-4］，还有部分接种者产生的抗-HBs滴度＜100 U/L，在体内持续存在时间较短，呈低应答状态。既往HBV疫苗无应答相关研究主要集中于疫苗因素、机体自身特征及环境特征、遗传因素、免疫相关分子特征等方面，本文主要对HBV疫苗接种无应答者的免疫相关遗传因素及免疫细胞分子特征研究进展进行阐述，旨在为HBV疫苗免疫无应答的机制研究提供理论依据。

1 HBV疫苗诱导抗体形成的机制

目前我国普遍使用的重组HBV表面抗原由于仅含HBsAgS蛋白，免疫原性较弱，必须与免疫佐剂——明矾联合使用。研究报道，明矾能够延长抗原在注射部位的存在时间，从而增强抗原提呈细胞摄取提呈能力［5-7］。B淋巴细胞产生抗-HBs的过程依赖于多重信号刺激，注射HBV疫苗后，树突状细胞或巨噬细胞被激活，捕获抗原后迁移至近端淋巴结发育成熟并处理抗原，将HBsAg以肽-MHCⅡ复合物形式呈递给T细胞，激活CD4+T淋巴细胞，促进其增殖并分泌Th2细胞因子，从而激活B细胞分化，转化为浆细胞，分泌抗-HBs［8］。另外，BCR也可识别并结合抗原使B细胞共受体［BCR-CD79a/b（BCRIgα/β）和CD19/CD21/CD81］胞内基序ITAM活化，B细胞活化后与Th细胞表面多对共刺激分子（如CD40/CD40L）相互作用，促进Th细胞分泌细胞因子IL-2、IL-4、IL-21、IL-6等，进一步促进B细胞增殖分化为浆细胞并产生抗体或分化为记忆性B细胞［9-10］。

2 HBV疫苗无应答者的免疫因素

2.1 HLA对HBV疫苗免疫应答的影响HLA，即人类白细胞抗原，其基因区域位于6号染色体短臂21.3区域，是3.6 Mb的高度多态性基因区域，含有270多个基因，其中几乎一半为假基因或非编码RNA。按编码分子特性不同，这些基因可分为三类，即HLA-Ⅰ类、HLA-Ⅱ类及HLA-Ⅲ类［11］。其中，HLA-Ⅱ基因负责将外源抗原呈递给CD4+Th细胞，由于多个HLA-Ⅱ基因变异与HBV疫苗接种、持续性HBV感染和自发性HBV清除有关而备受关注［12-15］。研究发现，HLA在决定疫苗免疫应答强度中起关键作用，参与调节婴幼儿及成人抗-HBs生成［16-18］。JAFARZADEH等［12］分 析 了HLA基 因 与HBV疫苗免疫应答相关性的一系列研究，总结出HLA-Ⅰ类（HLA-A、B、C等）、HLA-Ⅱ类（HLA-DP、DR、DQ等）及HLA-Ⅲ类（c2、c4等）基因中存在调控HBV疫苗免疫应答的基因，但在不同种族人群间不尽相同。几项全基因组关联研究显示，HLA-Ⅱ基因与疫苗应答有关，如位于HLA-DRBI基因上游12 kb的SNP（rs477515）是与中国汉族人群HBV疫苗无/低应答相关的独立标记及HLA-DR区可能是HBV疫苗诱导免疫的关键易感位点［13］；位于与HLA-Ⅱ类区域相邻的HLA-Ⅲ类基因富集区域中BTNL2基因（rs4248166、P55.51310212）与HBV疫苗应答显著相关，HLA-Ⅱ类等位基因DQB1*04：01、DPB1*05：01及3种DRB1-DQB1单体型（DRB1*04：05-DQB1*04：01，DRB1*08：03-DQB1*06：01、DRB1*14：06-DQB1*03：01）与日本人群HBV疫苗无/低应答相关［4］。

2.2 辅助/诱导性T淋巴细胞（Th）对HBV疫苗免疫应答的影响

2.2.1 TCR克隆频率 宋玉国等［19］报道，HBV疫苗无应答组TCR Vβ基因（Vβ2、Vβ8、Vβ9、Vβ11和Vβ17）单克隆改变频率明显低于有应答组，而无应答者CD4+T细胞Vβ5S2-3基因单克隆改变频率高于应答者，且TCRVβ基因对HBsAg的反应具有个体特异性。

2.2.2 Th1/Th2细胞的分子差异Th1/Th2细胞的细胞因子差异可影响Th1/Th2平衡，最终控制疫苗接种应答差异［20］。正常情况下，各亚群相互促进、相互拮抗处于平衡状态［21-22］。研究提示，HBV疫苗无应答者HBsAg特异性Th1细胞缺少，或T细胞虽存在对HBsAg具有特异性的TCR但对HBsAg肽-MHC复合物无反应［23-25］；Th1和/或Th2细胞产生的细胞因子IL-2、IFN-γ、TNF-β、IL-4缺乏而TGF-β增多［25-27］。此外，CD4+Th细胞介导的免疫应答需一些共刺激分子协同刺激才能充分启动，研究显示，乙肝疫苗无应答者共刺激分子CD25、CD69、CD25/CTLA4、CD80/CD86、CD40/CD40L、CD54及其配体LFA-1（ITGAL和ITGB）、CD58和CD2表达降低［28-31］。

2.2.3 滤泡辅助T细胞（Tfh）对HBV疫苗免疫应答的影响Tfh主要分泌转录因子B细胞淋巴瘤6（Bcl-6）、IL-21和IL-6受体（IL-6R），通过控制生发中心形成和细胞增殖分化在B细胞分化为浆细胞、产生抗体和Ig类别转换中发挥重要作用，是辅助B细胞应答的关键细胞，在体液免疫中起重要作用［21-22］。Tfh高表达CD44、CXCR5、ICOS、PD1、Bcl-6、IL-21、IL-6R，低表达CD62L、CCR7、PSGL1，Tfh发育依赖于IL-6、IL-21和信号转导转录激活因子3（STAT3），而不依赖于其他已知对Th1、Th2或Th17细胞分化很重要的细胞因子或转录因子［22］。Tfh与HBV疫苗免疫应答的相关报道较少。研究报道，HBV疫苗强应答组Tfh表达ICOS增强和IL-21分泌增多［32］；慢性HBV患者外周血CD4+CXCR5+Tfh频率显著增高［33-34］；IL-21可增强HBV特异性CD8+T细胞的抗病毒作用，促使HBV病毒清除和HBeAg/抗HBe血清学转换［35-36］，提示Tfh在抗HBV感染免疫应答中起重要作用。

2.3 Treg在HBV疫苗免疫无应答中的特征Treg主要在机体免疫系统中发挥负向调节作用，对效应细胞增殖、免疫活性发挥起抑制作用。SAKAGUCHI等［37］将Treg的功能归纳为免疫无能性和免疫抑制性。Treg不仅抑制CD8+T细胞增殖，且抑制其分泌细胞因子及杀伤靶细胞效应。研究发现，Treg分泌TGF-β作用于CD8+效应T细胞表面的Ⅱ型TGF-β受体，引起免疫抑制，同时，分泌的IL-10可抑制Th1和Th2细胞合成IL-2等细胞因子［38-39］。滤泡调节性T细胞（follicular regulatory T cells，Tfr）是一类专门在生发中心调控GCB和Tfh细胞应答的CD4+T细胞，来源于常规Treg，并同时兼具Tfh细胞表型特征（FOXP3+BCL6+CXCR5+Tfr）。叶丽林团队鉴定了mTORC1信号可在Treg磷酸化转录因子STAT3，磷酸化后的STAT3启动转录因子TCF-1生成，最终促进转录因子Bcl-6产生，从而推动Treg向Tfr分化，并最终通过调控生发中心反应调节抗体生成［40］。但Treg在HBV疫苗无应答反应中的具体机制尚未明确。研究报道，HBV疫苗低/无应答者体内存在Treg过度表达，但这些Treg是否具有HBsAg特异性及如何引起机体对疫苗低反应需进一步研究［41］。杨燕等［42］研究发现，HBV疫苗无应答者外周血Treg PD-1表达显著高于应答者，提示Treg可能通过PD-1/PD-L1途经发挥抑制效应。

2.4 B细胞功能障碍对HBV疫苗免疫应答的影响B细胞不仅能通过产生抗体发挥特异性体液免疫功能，也是重要的抗原提呈细胞参与免疫调节。另外，B细胞还表达多种含有ITIM的受体，这些受体招募负调节磷酸酶（如SHIP1和SHP1），抑制BCR信号［9-10］。VALATS等［43］研究发现，应答者分泌IgG型抗HBsAg抗体的细胞数明显多于无应答者，但体外实验发现来自应答者和无应答者的B淋巴细胞获得浆细胞表型的能力相同。SALIMZADEH等［44］研究发现，急、慢性HBV感染者体内存在一类功能障碍的HBsAg特异性B细胞，其特征为CD21和CD27低表达，但抑制性标志物如PD-1和转录因子T-bet却高表达。HBV疫苗低应答者体内是否也存在功能障碍的B细胞仍需要更深入的依据。

2.5 树突状细胞对HBV疫苗免疫无应答的作用 VERKADE等［45］在对慢性肾病患者接种HBV疫苗后的无应答者进行研究时发现，无应答者体内重要的抗原提呈细胞——单核细胞来源树突状细胞（monocyte-derived dendritic cells，moDC）的成熟活化标志MHCⅡ和CD83分子表达显著低于应答者，低活化的moDC影响抗原提呈，同时moDC刺激抗原特异性T细胞的能力也较应答者下降，导致机体对HBV抗原的低反应性。而采用GM-CSF与乙肝抗原共同注射对HBV疫苗低应答的B10.M小鼠，GM-CSF可通过募集和激活树突状细胞使小鼠产生高水平乙肝抗体，从另一方面证实HBV疫苗无应答中树突状细胞发挥重要作用［46］。

2.6 CD8+T细胞在HBV疫苗免疫无应答中的免疫特征HBV疫苗不仅可引起体液免疫应答，也会引起细胞免疫应答。CD8+T细胞通常称为细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL），主要通过两种途径发挥细胞免疫功能，一种途径是通过释放细胞毒素，如穿孔素、颗粒酶及颗粒溶解素诱发细胞凋亡信号，另一种途径是通过CTL表面的FAS配体与目标细胞FAS受体结合诱发细胞凋亡信号［47］。病毒特异性长寿CD8+T细胞在一些抗病毒疫苗（如黄热病毒、登革热病毒）引起的免疫应答中扮演重要角色［48］，而有关HBV疫苗无应答者CD8+T细胞的研究较少。WATANABE等［49］报道，CD8+T细胞影响无应答者接种HBV疫苗后T细胞增殖并在HLABw54-DR4-DRw53-DQw4单体型决定的个体乙肝疫苗无应答中发挥作用。NOWICKI等［50］发现无应答者CD8+T淋巴细胞数显著增多，而VINGERHOETS等［51］发现CD8+T淋巴细胞未参与无应答过程。

3 小结与展望

综上，机体通过复杂的免疫网络系统正向和负向调节机制限定抗原刺激产生的免疫应答强度、范围、作用程度及持续时间。国内外学者分别从机体各类免疫细胞数量、细胞因子分泌、分子表达水平等方面与HBV疫苗免疫应答强度的相关性进行了大量研究，为研究HBV疫苗无应答机制提供了科学依据。但各研究采取的实验技术、方法、方案和研究对象及数量不同，各类免疫细胞及其亚群在HBV疫苗免疫无应答中发挥的作用仍存在争议，并缺乏深层次的功能性研究，HBV疫苗免疫无应答的分子机制仍是疫苗领域的空白。因此随着分子生物学技术，如高通量测序技术、单细胞测序技术的发展，为进一步阐明HBV疫苗免疫无应答的分子遗传机制及开发更有效的HBV疫苗，有必要在多组学领域对HBV疫苗免疫无应答的机制进行多中心大样本量联合研究，并对相关分子进行功能验证。