白艺兰，刘 健，桂亚萍，夏炉明，龚国华，朱晓英，常晓静，陈伟锋，鞠厚斌，王 建，赵洪进

（上海市动物疫病预防控制中心，上海 201103）

上呼吸道感染（upper respiratory tract disease，URTD）是猫常见的临床疾病，是引起幼猫死亡的重要原因之一，通常由一种或多种病原感染引起，从而出现以呼吸道或眼部疾病为特征的猫呼吸道疾病症候群[1]。引起URTD 的病原很多，但主要为猫杯状病毒（feline calicivirus，FCV）、猫疱疹病毒1 型（feline herpesvirus type 1，FHV-1）和猫流感病毒（feline influenza virus，FIV）[2]。

FCV 在猫群中的感染率很高，常引起猫口腔溃疡和上呼吸道症状，也可引起其他疾病，如跛行、流产、慢性胃肠炎、尿道感染等。该病毒既可单独感染，也可与其他病原混合感染，严重危害猫及猫科动物的健康[3]。FHV-1 是一种高度接触性传染病原，也可垂直传播，引起的发病率很高，可达100%，但成年猫感染后病死率很低，幼猫感染后症状严重，病死率可达50%，未死亡的猫可终生带毒排毒，危害很大[4]。猫及猫科动物都对FIV十分易感，通过食入感染的动物性食品或接触感染的人和动物都很容易被感染。目前在猫及猫科动物身上已分离到多种亚型FIV，包括H1N1、H5N1、H5N6 及H7N2 等[5]。秋冬为猫呼吸道疾病高发季节，为此本研究对患有上呼吸道症状疾病的临床猫病例进行FCV、FHV-1 和FIV 的分离与鉴定，了解在该季节上海市猫上呼吸道疾病病例中FCV、FHV-1 和FIV 的感染比例，为猫上呼吸道疾病的防控和治疗提供依据。

1 材料和方法

1.1 样品及来源

2020 年11 月至2021 年3 月，以上海市中心城区宠物医院接诊的以及来自猫舍的具有上呼吸道感染症状的猫为研究对象，采集每只患病猫的眼结膜、口咽和鼻黏膜拭子53 份，其中宠物医院30 份、猫舍23 份，每个病例样品一式两份。样品采集好后立即送至上海兽医疾病诊断中心实验室进行病毒分离与鉴定。

1.2 主要试剂

F81 细胞（猫肾传代细胞），由上海兽医疾病诊断中心实验室保存；SPF 鸡胚（批号11401000020754），购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司；DMEM 细胞培养液（批号2126865）、0.25% 的胰酶消化液（批号2042303），均购自GIBCO 公司；胎牛血清（批号2418），购自SIGMA 公司；核酸提取试剂盒（批号MDII14-01），购自Magen 公司；PrimeScriptTMRT-PCR Kit（批 号AJ62323A）、LA PCR™ Kit Ver.2.1（批 号AK5301）、Prime Script™ One Step RT-PCR Kit Ver.2（Dye Plus）（批号AKE0559A），均购自宝生物工程（大连）公司。

1.3 病原分离、鉴定及同源性分析

1.3.1 FCV F81 细胞常规消化传代，待长成单层且贴壁率达到90%时，将细胞按照1:3 的比例消化传代，同时将待测样品经过0.22 µm 滤膜过滤后同步接种到细胞中，放入37 ℃，5% CO2培养箱中培养，每12 h 观察细胞病变（CPE）1 次；待70%细胞出现CPE 时，将培养液冻融3 次，2 000 r/min离心5 min，收获细胞上清；96 h 后将未出现CPE的细胞上清收获，盲传3 代，收获第3 代细胞上清提取病毒RNA。根据文献[6]合成FCVVP1基因检测引物（上游：ATGTGCTCAACCTGCGC；下游：TCATAATTTAGTCATTGAGCTCCT），扩增片段大小为2 007～2 010 bp。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。按照PrimeScriptTMRT-PCR Kit 说明书进行PCR 扩增后取5 μL RT-PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性RT-PCR 产物送上海桑尼生物科技有限公司进行测序。应用MEGA 6.0 软件和DNAstar v7.1 软件，对FCVVP1基因序列进行遗传进化分析，比较其与GenBank 中参考序列核苷酸同源性差异，绘制基因进化树。

1.3.2 FHV-1 按照1.3.1 中的病毒分离步骤进行病毒分离，将收获的第3 代细胞上清提取病毒DNA。根据FHV-1gB基因保守序列（S49775.1）合成基因检测引物（上游：GGGGTGGGTGGACGGTGAGTAA；下游：TAGGTCTCCAGGGTTCCAGTCT）。扩增片段大小为1 798 bp。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。按照PrimeScriptTMRT-PCR Kit 说明书进行PCR 扩增后取5 μL PCR 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，阳性PCR 产物送上海桑尼生物科技有限公司进行测序。应用MEGA 6.0 软件和DNAstar v7.1 软件，对FHV-1gB基因序列进行遗传进化分析，比较其与GenBank 中参考序列核苷酸同源性差异。

1.3.3 FIV 将另外一份待检样品经0.22 µm 滤膜过滤后尿囊腔接种到10 日龄SPF 鸡胚中，37 ℃孵化箱中培养，每24 h 照胚1 次，并将死亡鸡胚及时保存至4 ℃冰箱，96 h 后将所有鸡胚放至4 ℃冰箱过夜，收获鸡胚尿囊液，测定其血凝性；如有血凝性则作进一步鉴定，没有血凝性则进行盲传，收获第3 代鸡胚尿囊液作进一步鉴定；对鸡胚尿囊液进行HA 试验，根据文献[7]合成引物对HA 和NA 编码序列进行测定（HA 上游：GGGGAATTTCACAACCACTCAAG；HA 下游：TTGAGTAGAAACAAGGGTGTTTC。NA 上游：AGCAAAAGCAGGAGTRAAAATGA；NA 下游：GGCAAGTAGAAACAAGGAGTT）。扩增片段HA 为1 742 bp，NA 为1 457 bp。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。PCR 扩增后经1%琼脂凝胶电泳检测。

2 结果

2.1 细胞接种

将处理好的53 份猫眼、口、鼻拭子样品接种F81 细胞，共有33 份样品出现了CPE，细胞表现出聚集、圆缩、脱落、崩解等现象（图1）。

2.2 FCV 分离及鉴定及VP1 基因同源性和遗传进化分析

2.2.1 分离及鉴定 将53 份样品的细胞上清液进行FCVVP1基因PCR 鉴定，发现共有31 份细胞上清出现2 010 bp 左右目的条带（图2），与预期片段大小相符。53 份样品的FCV 分离率为58.49%（31/53），其中宠物医院样品分离率为46.67%（14/30），猫舍样品分离率为73.91%（17/23）。

2.2.2VP1基因同源性和遗传进化分析 FCVVP1序列比对分析结果（表1）显示：31 株分离株间的核苷酸同源性为75.3%～99.8%，与国内FCV 疫苗株255 的同源性为74.8%～78.3%，与国外FCV 疫苗株F4 的同源性为73.7%～78.6%，与跛行综合征株2280 的同源性为74.3%～79.0%，与2016 年发现的美国超强毒株VS-FCV-Ari 的同源性为73.9%～77.1%。同国际分离株相比，31 株分离株与美国3786 株的同源性较高，与美国超强毒株VS-FCV-Ari 的同源性最低。与国内分离株相比，与国内吉林株CH-JL4 的同源性最高，与湖北HB-S4 株的同源性最低，与2014 年上海SH2014 株的同源性为75.9%～80.3%。相应的氨基酸序列分析表明，31 株分离株与255 疫苗株的同源性为85.5%～89.1%，与F4 疫苗株的同源性为83.1%～90.1%，与超强毒株VS-FCV-Ari 的同源性为82.3%～86.8%，与上海SH2014 株的同源性为83.7%～89.5%。FCVVP1基因遗传进化分析结果（图3）显示：31 个分离株总体上可以划分为3 个分支。第一分支只包括FCV20-11 和FCV20-29，其与疫苗株、超强毒株和国内外的一些分离株亲缘关系较近，形成一个独立分支，进化关系最为复杂，来源也最为广泛；第二分支只包含14 株分离株，遗传进化关系最为简单，已经形成独立的遗传进化谱系；第三分支包括15 株分离株及其他3 株国内毒株。结果表明，FCV 进化关系较为复杂，且本地分离株具有多样性。

表1 31 株FCV 分离株与各参考毒株VP1 基因同源性比较结果 %

2.3 FHV-1 分离、鉴定及gB 基因同源性分析

2.3.1 分离与鉴定 将上述细胞上清液作为模板，进行FHV-1gB基因PCR 检测，结果有2 份细胞上清出现1 798 bp 左右目的条带（图4），与预期片段大小相符，FHV-1 的分离率为3.77%（2/53），2 份样品均来自于宠物医院。

2.3.2gB基因同源性分析 FHV-1gB基因序列比对分析结果（图5）显示，2 株分离株间的核苷酸同源性为100%，与国内株（GD2018、CHB）、美国经典株（C-27）、澳大利亚株（Feligen）及其他参考株的同源性均为100%。

2.4 FIV 鉴定

将53 份尿囊液进行HA 检测，结果均为阴性，未分离到病原。将其第3 代尿囊液进行HA 通用RT-PCR 检测，结果也均为阴性。

3 讨论

近年来随着人民生活水平的提高，猫作为伴侣动物已逐渐成为城市生活的一部分。经过初步统计，上海市家养宠物猫数量已达21 万只，流浪猫数量更是达到了27 万只。猫上呼吸道疾病在大量猫同居的环境中尤其严重，包括动物收容所、猫舍和半野生动物群落[7]。FCV 和FHV-1 被认为是引起猫上呼吸道疾病的主要病原，常引起鼻气管炎、结膜炎和鼻/面部溃疡等[8]，虽然原发感染相对轻微，但继发感染对幼猫或免疫功能低下的猫构成较大威胁，并可能导致致命后果，而FIV 可能会对家养伴侣动物及人类健康带来重大影响[9]。

本研究通过细胞培养和鸡胚接种方法，对上海市秋冬季部分具有上呼吸道症状猫的眼、口、鼻拭子进行FCV、FHV-1、FIV 分离鉴定，发现FCV分离率为58.49%（31/53），其中猫舍样品的分离率高达73.91%（17/23），推测主要原因是猫舍为群居场所，猫间接触频繁，容易造成相互传染，因此猫的频繁接触和混居是FCV 传播和流行的重要因素。FHV-1 分离率不高，仅为3.77%（2/53）。FHV-1 是间歇排毒，并且大多数情况下潜伏在三叉神经，所以病毒分离相对较为困难[10]。2 株分离株间的核苷酸同源性为100%，与其他参考株的同源性同样均为100%。目前对FHV-1 分离株的研究相对较少。国内王吉[11]等分离的5 株FCV 分离株的核苷酸与参考株同源性大于99%。同时有研究[12]表明，FHV-1 与其他水痘病毒的gB基因具有高度相似性。gB 蛋白作为免疫原性蛋白，在哺乳动物细胞中究竟如何影响FHV-1 感染宿主及其在宿主体内的增殖仍需进一步研究证明。31 份FCV 阳性样本中未同时分离得到FHV-1。虽然两种病毒都能感染F81 细胞，但是两者的CPE 和生长曲线并不一致，可能导致两者不能同时被分离到。采用鸡胚接种方法未分离到FIV，可能是临床猫FIV 感染率较低，也可能与FIV 的一过性感染特性有关，或者是该病毒培养方法并不适用FIV 分离，具体原因有待进一步研究。本研究采集临床中具有呼吸道疾病症状猫的口鼻拭子样本进行检测，所得结果为病毒核酸检出率，不能代表猫的实际感染情况。

FCV 虽然只有1 个血清型，但抗原很容易变异。目前针对FCV 感染无特效药，疫苗是控制该病的重要手段。在分离到FCV 的31 份临床病例中，70.97%（22/31）的病例都免疫了进口“妙三多”（FPV、FCV 和FHV-1）疫苗，但仍然感染FCV 并导致发病，说明目前的猫三联疫苗并不能保护机体抵御所有FCV 毒株的感染，因此疫苗保护率差是造成FCV 感染的因素之一。国内同样有研究[13]显示，该疫苗对FCV 保护力不佳。有研究[14]表明，使用灭活的FCV 颗粒进行鼻内免疫可对猫的同源和异源病毒提供强有力的保护。通过反向遗传技术也使FCV 疫苗研究取得了一定进展[15]。本研究中，FCV 分离株间的核苷酸同源性为75.3%～99.8%，与FCV 疫苗株255 和F4 的同源性都不高，与美国超强毒株VS-FCV-Ari 的同源性只有73.9%～77.1%。国内相关研究[16-17]同样表明，FCV 感染比较普遍，且毒株相互间的同源性不高，来源复杂。因而，今后有必要继续进行FCV 等病毒的流行情况调查。

综上所述，本研究通过细胞培养分离获得了31 株FCV 分离株和2 株FHV-1 分离株，并进行了基因序列分析，初步了解了上海市猫上呼吸道疾病病例中FCV、FHV-1 和FIV 的感染比例以及病原的遗传变化特点，为猫呼吸道病毒性疾病诊断试剂及疫苗研究奠定了基础。