李巧艳，吕 菁，马茹娟

(中检西北计量检测有限公司，陕西 西安 710068)

聚合酶链反应(PCR)分析仪通常由控制模块、温控模块、光电模块、机械模块、电源模块和软件(控制与数据处理软件)等组成，再新冠病毒肺炎抗疫中聚合酶链反应(PCR)分析仪作为核酸检测的重要仪器，其中聚合酶链反应(PCR)分析仪中温度控制模块是聚合酶链反应分析仪最很重要的组成部分，温度校准也是最非常重要的计量参数之一。其温度的准确性、均匀性和升降温速率等参数直接影响着其扩增的过程。由于PCR仪是成倍扩增的过程，任何微小的温度变化都可能影响温度的准确性，温度准确性降低可能会导致核酸检测结果的异常，甚至是错误的结果,从而导致检测结果异常。目前常见的PCR仪温度控制部分有24孔、48孔、96孔等，其中96 孔的最为常见。在《聚合酶链反应分析仪校准规范》中 PCR仪校准用标准器主要是由若干个准确度高，稳定性好的温度传感器、数据采集读数分析装置组成。测量温度范围一般为0～120 ℃，温度校准装置测量不确定度≤0.1 ℃。PCR仪温度校准装置标准器需要在校准仪器时候必须将温度探头靠紧加热孔，温度传感器准确度必须足够高、响应速度够快、数据传输线能够保证PCR在盖板闭合的情况是运行正常等要求，故PCR仪温度校准装置一般都是定制的精密设备。由于PCR仪基板插孔较小，而且形状特殊，必须对温度传感器进行特殊的加工设计，以紧密贴合聚合酶链反应(PCR)分析仪基板插孔内，提高温度测量的准确性。由于PCR反应需要温度在30～95 ℃之间快速转换，热敏电阻材料必须具备良好的导热性能，响应时间快,故温度探头一般使用热敏电阻，常用铜作为封装材料，封装器件的尺寸完全依据聚合酶链反应分析仪校准规范中要求进行设计，热敏电阻传感测温头部分由导热胶封装固定在铜质圆台内部，并可与PCR仪基板插孔直接接触，既保证了热敏电阻的热响应时间不受影响，也保证了热敏电阻与PCR仪基板插孔的紧密贴合，提高了PCR仪温度测量的准确度[1]。

聚合酶链反应(PCR)分析仪是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分析类仪器，其最大特点是能将微量的DNA按照成倍增加。尤其在此次新冠病毒防疫大战中，PCR分析仪是病毒检测中最为重要的设备，其工作性能是否良好，检测校准结果是否准确可靠，将直接影响病毒检测结果的时效和准确性，因此，对PCR分析仪的校准尤为重要。在计量校准过程中测量不确定度是计量中必不可少的一个重要要素，测量不确定度是根据所用到信息，表征赋予被测量量值的分散性，是一个非负参数，也表明其测量结果的可信赖程度，是表征测得值的分散性或所在区间的半宽度，测量不确定度越小，其测得值分散性越小，区间半宽度越窄，反之则相反，测量不确定度评定方法应依据1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》，又称GUM评定方法或CUM法，GUM评定方法首先分析测量不确定度的来源，测量不确定度来源一般应考虑被测量的定义不完整、复现被测量的测量方法不理想、对测量过程中对环境的测量与控制不完善、引用的数据或其他参考量值的不准确等，有时已经对测量结果进行修正，给出的是修正后的测量结果，则还要考虑修正值不完善引入的测量不确定度。一般情况下，在考虑测量不确定度影响因素时，应全面的考虑被测量、测量环境、测量仪器、测量方法等因素。尤其考虑对测量结果有较大的不确定度因素。以下情况不属于测量不确定度的来源：(1)在测量过程中，操作人员将数据读错、记错；(2)仪器突然跳动等异常情况；(3)测量结果中的异常值。本文根据1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》要求以及JJF1527-2015《聚合酶链反应分析仪校准规范》对聚合酶链反应分析(PCR)仪校准过程中产生的温度示值误差进行评定，为正确评价和使用校准结果提供了更为合理和科学的依据[2]。

1 概 述

1.1 测量依据

JJF1527-2015《聚合酶链反应分析仪校准规范》[3]。

1.2 测量环境条件

仪器使用允许的环境条件，测量过程中应测量和记录环境的温度、相对湿度。

1.3 测量标准

表1 标准器配置表Table 1 Standard configuration table

1.4 被校对象

聚合酶链反应分析(PCR)仪。

1.5 测量方法

(1)校准前需将聚合酶链反应分析(PCR)仪开机并提前预热30 min；

(2)将PCR仪及温度校准装置中标准器各部件与数据采集分析仪连接好并开机，还要在温度传感器表面上涂抹适量的导热油；

(3)按规程要求将温度传感器放置于PCR仪加热孔中首先进行模拟测试，或者参照客户提供的PCR仪说明书要求设定其温度控制程序；

(4)全部准备完成后启动温度校准装置标准器，记录整个采集过程并保存原始记录，便于最终的数据处理。

1.6 测量不确定度校准结果的使用

符合上述条件的测量结果，一般可参照使用本不确定度的评定方法。

2 数学模型

式中：ΔTd——温控装置工作区域内温度示值误差，℃

Ts——温控装置工作区域内设定温度值，℃

3 测量不确定度来源分析

(1)聚合酶链反应分析仪校准结果测量重复性引入的不确定度；

(2)温度校准装置标准器温度传感器引入的不确定度。

4 测量不确定度分量计算

4.1 聚合酶链反应分析仪校准结果测量重复性引入的不确定度

在各个温度校准点的测量时间段内，分别读取15个温度传感器的数据，见表2，计算其实验标准偏差s。

表2 重复性引入不确定度数据Table 2 Repeatability introduces uncertainty data

根据测量结果计算：

4.2 温度校准装置标准器温度传感器引入的不确定度

温度校准装置标准器温度传感器校准不确定度由标准温度传感器校准证书得到，取包含因子k=2。

5 合成不确定度

5.1 测量不确定度分量汇总及计算表

表3 标准不确定度汇总表Table 3 Standard uncertainty summary table

5.2 合成标准不确定度计算

5.3 扩展不确定度评定

取包含因子k=2，则PCR仪温度示值误差的扩展不确定度用U=2u(Δ)计算，结果见表4。

表4 合成不确定度和和扩展不确定度计算结果Table 4 Calculation results of synthetic uncertainty and extended uncertainty

6 结 论

(1)该文聚合酶链反应分析仪不确定度是根据JJF1527-2015《聚合酶链反应分析仪校准规范》评定，聚合酶链反应分析仪校准不确定度评定主要来源于：1)聚合酶链反应分析仪校准结果测量重复性引入的不确定度，采用A类评定方法；2)温度校准装置标准器温度传感器引入的不确定度，采用了B类评定方法。然后合成测量重复性和标准装置温度传感器的标准不确定度uc，最后取包含因子k=2，计算出扩展不确定度U。

(2)在整个PCR温度参数校准的过程中，需要注意：①采用的定制温度校准装置标准器能够满足不同种类的PCR仪检测，其测温探头必须能够完全紧贴于PCR仪反应孔内，不同厂家 PCR仪结构各不相同，反应孔一般具有0.1 mL或者0.2 mL两种型号，使用的温度校准装置标准器需满足紧贴性要求，否则影响聚合酶链反应分析仪温度均匀性等结果的准确性，由于温度相关参数的校准主要采用专用的温度采集分析装置，一般分为有线或者无线两种传输数据探头，若使用有线温度校准装置标准去时需在PCR仪盖板闭合的情况下不影响设备运行；②聚合酶链反应分析仪温度参数校准时需先打开校准设备并预热，在进行PCR仪温度程序设定，同时至少进行2个循环以上的反应过程，便于温度示值误差和温度均匀度数据的采集，数据采集的时候尽量等温度指标平稳后再选温度点进行记录，减小温度过冲对于结果的影响；③温度校准装置标准器应该定期进行维护和自身校准，保证其量值的准确性与校准装置的稳定性[4]。

(3)PCR仪技术的进步，能够很好的解决了温度不均匀性的问题，为PCR实验数据提供了温度保障，确保了实验数据的准确性和可靠性，稳定的温度控制系统，数字化的显示模式，使实验的显示和操作更为清晰和直接，甚至考虑到了PCR反应体系对温度变化的影响，模块具有温度梯度功能，为科研工作者提供30 ℃的温度梯度范围，能够满足各种实验需求。PCR仪控温精度更高、升降温更快、模块温度更均匀、外形体积更小、运行环境更安静，能够使初学者可以快速、安全地学会使用。

(4)PCR仪在实验室质量管理及维护时注意事项：

①使用PCR仪式要严格遵守本机说明书中规定的环境条件、电源、灰尘、振动等的要求；

②打开PCR仪仪器时候动作要轻盈，以防把仪器损坏；

③PCR仪工作状态时候禁止对仪器进行操作；

④要定期使用无水酒精清洁加热孔，在清洁前PCR仪一定要关掉电源；

⑤进入PCR实验室的需要用PCR仪进行样品检测的人员，需要经过从基础理论、实验原理、规范操作、质量保证到注意事项等规范的培训；

⑥产品出现故障时要及时请专业的维修人员或厂家的维修人员维修。

(5)随着科技的不断进步发展，聚合酶链反应分析仪是完成聚合酶链反应的必备仪器，是微量核酸测量必须的主要设备之一，PCR仪技术的应用也也在不断更新与完善，它将渗透到生活的各个领域，也已经广泛普及于生物学相关的各个实验室，在农业、医学、环境检测、食品、医药、基因工程等方面应用更为广泛[5]。