邱 晨，常 珺，王帅兵，范丽娜，贾浩田，郝瑞杰*

（1.山西农业大学 城乡建设学院，山西 太谷 030801；2.山西农业大学 园艺学院，山西 太谷 030801；3.山西农业大学 资源环境学院，山西 太谷 030801）

花香是观赏植物的主要品质指标，其能有效提高观赏植物的经济价值和观赏价值，也能影响人们的情绪、心理状态、社交行为等［1］。通过调控花香物质的组成和用量，可以开展灵活的“芳香疗法”，从而实现保障人体健康或缓解疾病痛苦的目标［2］。花香是植物重要的次生代谢产物，其由多种小分子化合物组成［3］，国内外已从90个属991种植物中鉴定出2000多种花香物质［4］，主要包括酯类、醇类、萜烯类、烷烃类、芳香烃类、醛类、酮类以及醚类等［5-6］。花香物质的释放由植物自身遗传特性决定，但生物、环境等众多外界因素也会影响植物花香物质的挥发，如害虫、真菌、温度、激素、外源调节剂等［7-10］。

生产中已经发现多种调节剂可以影响植物花香物质的挥发［10-11］，如甘草酸是一种两亲性分子，可以自由组装形成主客体复合物，从而将客体分子包裹起来，提高其溶解度，起到抑制次生代谢产物转运和挥发的作用［12］。槲皮素是基于类黄酮结构的一类具有生物活性的化合物，其与植物多种功能有相关作用［13］，外源槲皮素处理可以通过参与ABA信号通路和降低ATP合酶的活性，从而抑制拟南芥中生长素等次生代谢产物的运输［14］。钒酸盐是一种重要的ABC转运蛋白活性抑制剂［15］，在拟南芥中外源添加钒酸盐可抑制液泡膜对水杨酸的转运［16］。在烟草悬浮细胞检测PhABCG1转运苯甲酸甲酯的试验表明，正钒酸钠可有效抑制矮牵牛关键芳香物质的挥发［11］。目前，利用外源调节剂调控植物花香机理研究仍未阐明，生产中也缺乏有效的花香调节剂，因此继续开展观赏植物花香调节剂研究意义重大。

梅花 (Prunus mume Sieb. et Zucc)为蔷薇科杏属落叶观花小乔木，是我国十大传统名花之一，自古就与国人的生产、生活和文化结缘，深受人们喜爱。前人研究揭示梅花花香的主要特征物质是乙酸苯甲酯、苯甲醇、苯甲醛等，梅花已成为研究苯环类物质合成与挥发的模式植物［17-19］，而有关外源调节剂对梅花花香性状影响的研究鲜有报道，其调控方式和影响机制尚不清楚。本研究以梅花彩枝舞粉为材料，利用甘草酸、槲皮素、正钒酸钠这3种外源试剂喷施处理，采用顶空固相微萃取和气质联用(HS-SPME-GC-MS)技术，对不同处理后盛花花朵进行挥发成分检测分析以探究3种花香调节剂对梅花挥发性状的影响，以期筛选出有效的花香挥发调节剂，为指导后续的花香应用和花香调控工作提供实践依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以山西农业大学校内栽培的梅花彩枝舞粉(Prunus mume ‘Caizhiwufen’)为试材，剪切带有盛花期梅花花朵的枝条插入超纯水中，置于20 ℃恒温光照培养箱培养（瑞徽电子上海有限公司），光周期为12 L/12 D，光照强度为5000 lx。外源花香调节剂为甘草酸、槲皮素、正钒酸钠，均购买自麦克林公司。

1.2 试验方法

1.2.1 外源调节剂处理试验采用2 mmol/L甘草酸、槲皮素和正钒酸钠3种外源调节剂，选择长势一致的盛花期梅花花朵分别喷施此3种不同的外源试剂，以喷施清水为对照，每个处理重复3次。

1.2.2 花香采集与分析使用气相色谱—质谱联用仪（Trace ISQ型号，Thermo公司），参考袁颖的研究方法中设定的SPME-GC-MS工作条件［20］，将不同处理的盛花花朵离体称重后置入20 mL顶空进样瓶中，挥发成分鉴定采用NIST08谱库检索结合人工解析图谱共同确定，挥发物成分定量分析采用外标法［21］。

1.2.3 徒手切片观察将梅花花瓣表皮分离后制成徒手切片，选取合适的切片在正置显微镜（日本Nikon公司，NI-U）下对花瓣表皮细胞结构及形态进行观察并拍照。

1.2.4 FDA染色观察称量5 mg FDA溶于1 mL丙酮中，4 ℃保存为贮备液。用20%的蔗糖将贮备液稀释50倍并混合均匀，配制成浓度为100 μg/mL的FDA测定液。取不同处理后花瓣表皮制成徒手切片，于室温下浸泡在FDA测定液中，黑暗处染色7 min后在显微镜（Nikon Ni-U、Nikon C-HGFI荧光发射源、Nikon-Fi3相机）上进行观察和拍照，激发光为蓝色，目镜为10倍，物镜为4倍。

1.3 数据分析

试验采用Thermo Xcalibur和Microsoft Excel 2016软件进行数据整理，用The SAS System for Windows V8软件进行统计分析，采用AVONA进行显著性检验（P＜0.05），采用Origin 2019b软件进行图表绘制。

2 结果与分析

2.1 花香调节剂对梅花花香主要挥发物质的影响

由不同外源花香调节剂处理后梅花彩枝舞粉花香离子流（图1）所示，与清水处理相比，处理后挥发物总离子流图中峰数量及其相应峰面积差异明显，各处理间也存在明显差别。但不同处理的梅花花香主要物质种类未发生明显变化，均为乙酸苯甲酯、苯甲醇、苯甲醛、丁香酚等。由不同外源调节剂对彩枝舞粉花香总挥发量的影响（图2）可知，与清水对照相比，各处理的花香挥发物释放总量均有所降低，其中经甘草酸和正钒酸钠处理的花香挥发物总释放量均显著降低，且正钒酸钠处理的下降幅度最明显，达到了44.75%；而槲皮素处理的花香挥发物总释放量与清水对照相比差异不显著。

图1 不同调节剂处理梅花花香离子流

图2 不同调节剂对梅花花香挥发物总挥发量的影响

2.2 花香调节剂对梅花花香挥发物类别的影响

梅花花香挥发物的归类情况如图3所示，各处理中共检测到的40余种挥发物，主要分为酯类、萜烯类、苯环类、烷烃类、醇类、醛类、酸类、酮类和其他共9个类别，其中数量最多的是酯类，其次是苯环类，两者共占总类别的50%左右。由图3可知，与清水处理相比，甘草酸处理可有效增加梅花花香挥发物中酯类、苯环类、醇类、醛类和其他类物质的数量，并使得烷烃类和酸类物质数量减少，而萜烯类物质并未检测到。经槲皮素处理后，梅花花香挥发物中的酯类、烷烃类、醇类和醛类物质数量与清水对照相比保持不变，萜烯类物质的数量明显减少，其他类物质的数量明显增加，而酸类物质未检测到。正钒酸钠处理对梅花盛花花朵释放挥发物种类数量的影响较大，其挥发物总种类有30种，较清水对照减少了30.23%，其酯类、烷烃类物质的数量明显减少，萜烯类物质未被检测到，其余种类物质数量与清水对照组相比基本保持不变。

图3 不同调节剂对梅花花香挥发物种类的影响

2.3 花香调节剂对梅花花香不同类别挥发物释放总量的影响

由各处理中挥发物质中各类别释放量(图4)可知，花香挥发物中酯类、苯环类和醇类物质的平均释放量均相对较高（图4），且酯类是梅花花香成分中的主要物质，至少达到了205.09 ng/(g·h)，其次是醇类，苯环类、醛类、烷烃类、萜烯类、酸类、酮类和其他类物质的含量依次减少。与清水对照相比，经不同外源花香调节剂处理后，花香成分中酯类、萜烯类、苯环类、烷烃、酸类和酮类物质的挥发均受到了明显抑制。喷施甘草酸溶液后，梅花花香挥发性成分中醇类物质的释放量显著增加，酯类、苯环类、烷烃类、酸类、酮类物质的释放量均显著减少，萜烯类物质的释放量为0；经槲皮素处理后，醛类物质的释放量显著增加，酯类、萜烯类、苯环类、醇类、酮类物质的释放量显著减少，而酸类物质则无法被检测到；正钒酸钠处理显著提高了醛类物质的释放量，酯类、苯环类、烷烃类、酸类和酮类物质的挥发受到了明显抑制，而萜烯类物质的挥发受到了完全抑制。

图4 花香调节剂对梅花花香不同种类挥发物释放量的影响

2.4 花香调节剂对梅花花香主要挥发物释放量的影响

通过对处理后梅花彩枝舞粉的挥发物进行鉴定和统计，从40多种不同的挥发物成分中筛选出了9种代表性成分，并对这9种成分的释放量进行分析。从图5可以看出，乙酸苯甲酯和苯甲醇是梅花彩枝舞粉主要的花香成分，一些酯类和苯环类物质的释放量也相对较高。经不同外源花香调节剂处理后，大部分挥发物质释放量均显著降低，如乙酸苯甲酯、苯甲醇、丁香酚、乙酸己酯、乙酸异戊酯、正二十一烷、苯酚、乙酸叶醇酯，尤其是乙酸苯甲酯的挥发量降低了50%以上，在甘草酸处理中的挥发量仅为107.39 ng/(g·h)。而甘草酸、槲皮素和正钒酸钠处理均使得正二十一烷消失；喷施甘草酸溶液后，苯酚无法被检测到；正钒酸钠处理后，苯甲醛的挥发量显著提升，达到了34.07 ng/(g·h)，相当于清水对照的3倍，而乙酸叶醇酯无法被检测到。

图5 不同调节剂对梅花花香9种主要挥发物释放量的影响

2.5 花香调节剂处理后梅花花瓣表皮细胞观察

由梅花花瓣徒手切片观察结果（图6）显示，各调节剂处理下花瓣表皮细胞整体均呈现淡粉色，细胞间以镶嵌结构形式紧密排列，与对照相比，细胞形态未见明显变化。花瓣表皮细胞FDA染色观察结果（图6）显示，所有花瓣表皮细胞均在蓝光下呈现黄绿色荧光，且不同外源调节剂处理后的花瓣表皮细胞较对照荧光差异不明显，表明处理后花瓣表皮细胞膜未被破坏且仍具有完整性，花瓣表皮细胞活力未见明显改变。

图6 花香调节剂处理后梅花花瓣表皮徒手切片与FDA染色观察

3 讨论与结论

花是植物主要的观赏部位，花香也是人们关注的焦点之一。近年来，随着花香挥发性物质提取和检测技术的进步与发展［22］，众多植物花香成分已被鉴定出来，且对花香性状调控的研究取得了较大进展［23-24］，外源调节剂能有效影响植物花香物质的挥发与合成，但各调节剂所产生的影响差异较大。外源NO会抑制牡丹不同花期花瓣挥发性成分中烷烃类、醇类和芳香烃类物质的挥发，并影响其花期花瓣挥发性成分的种类及含量，但对萜烯类和酮类物质影响不大［25］。外源乙烯处理可以提高白姜花萜类花香物质的释放量［26］，而使香豌豆花主要花香挥发物芳樟醇大量减少［27］。外源茉莉酸甲酯对玫瑰花香物质的释放具有明显促进作用［28］，但喷施50 μmoL/L茉莉酸甲酯对百合花瓣的花香挥发物释放产生了抑制作用［29］。而在本研究中，3种外源调节剂处理均使梅花彩枝舞粉花香挥发性物质的总挥发量降低，说明不同调节剂作用效果不同，对不同植物花香性状的影响也不同。清水对照处理梅花花香主要挥发物乙酸苯甲酯的挥发量占总挥发量的52.63%，甘草酸、槲皮素、正钒酸钠处理后乙酸苯甲酯的挥发量分别降低了64.18%、58.01%、45.66%。由此可见，3种外源调节剂均能有效抑制乙酸苯甲酯的挥发，梅花花香总挥发量的降低也主要归因于乙酸苯甲酯挥发量的降低。

植物花香主要来源于花瓣释放的多种挥发性香气成分，本研究发现不同外源调节剂处理并未破坏梅花花瓣表皮细胞膜的完整性和影响其细胞活性，但梅花花香总挥发量明显降低，这说明外源调节剂对花香性状的影响不是基于细胞结构的破坏，可能是外源调节物质干预了梅花花香物质挥发的进程。在矮牵牛中发现了ABC亚家族的ABCG转运蛋白PhABCG1参与了转运苯甲酸甲酯和苯甲醇［11］；Hao等［30］证实了ABCGs参与蔷薇科植物梅、桃、杏中苯甲醛的挥发。ABC转运蛋白利用水解ATP释放的能量来特异性转运相关产物［31-33］，而正钒酸钠可以抑制ATP的水解，其已被证实为一种有效的ABC转运蛋白抑制剂［34］。本试验中，正钒酸钠处理后大量挥发物质的挥发量均大幅减少，而苯甲醛的挥发量显著增加，这可能与正钒酸钠处理后，梅花处于逆境环境中，触发了梅花自身的防御机制，释放出大量苯甲醛吸引昆虫进行授粉有关［35］。有研究表明，甘草酸与槲皮素能够抑制ABC转运蛋白的功能从而影响次生代谢产物的运输［36-38］。本研究发现，槲皮素与甘草酸的处理也显著降低了梅花花香物质的挥发量，推测甘草酸与槲皮素也可能是通过调控相关转运蛋白的功能以减少花香物质的挥发。

植物挥发性成分种类和含量差异对其独特香气特征的形成起到关键作用。童盼盼等［39］使用特定外源调节物质喷施库尔勒香梨后，果实主要挥发性物质及特征香气含量显著提高，导致果香发生明显变化。侯丹［7］研究表明温度变化对桂花花香释放产生显著影响，烷烃类化合物比例增加，使桂花香气浓淡发生变化。裴龙英［40］发现不同处理的哈密瓜汁香气有明显改变，特征酯类挥发性物质减少以及醛类物质占比增加导致果汁香气明显减弱。本试验中，3种外源调节剂在有效抑制梅花花香总挥发量的同时，还使其花香成分的种类、含量以及特征花香物质的比例发生改变，导致处理前后梅花花香性状的差异，而不同调节剂对梅花香气特征的改变起到不同效果。甘草酸、槲皮素处理后梅花主要花香物质含量均显著减少，主要成分为乙酸苯甲酯、苯甲醇、苯甲醛、丁香酚等；正钒酸钠处理后梅花主要成分为乙酸苯甲酯、苯甲醛、苯甲醇、乙酸己酯等，表现为苯甲醛含量的显著提高和丁香酚含量明显减少。因此，可以充分利用特定外源调节剂达到调控观赏植物花香的效果，进而改善园林观赏植物因花香过于浓郁引起人体不适的现状。

综上所述，使用外源调节物质喷施梅花彩枝舞粉盛花期花朵，其挥发物总释放量受到明显抑制，并导致挥发物种类以及主要花香物质含量减少。不同调节剂对花香总挥发量的影响程度存在差异，正钒酸钠的抑制作用强于甘草酸和槲皮素，不同外源调节剂对梅花花香成分中不同物质的种类和数量的影响差异可能与ABC转运蛋白被特异性调控有关。因此，关于喷施外源调节剂对植物花香性状影响的探索，可为人工调控植物芳香性状提供了借鉴，也为芳香植物材料的应用提供了新的思路，后续可将关键ABC转运蛋白基因作为切入点，是今后从基因水平上进行花香调控和香花植物应用的有效途径之一。