宋洪艳，赵 航，严 霞，史晓凤，马 君

中国海洋大学光学光电子实验室，山东 青岛 266100

引 言

多氯联苯(polychlorinated biphenyls，PCBs)是指联苯上的氢被氯取代形成的一类有机化合物,一度被广泛应用于各种工业领域。PCBs极难降解，具有致癌、高脂溶性特点，容易在海产品中富集,且能够通过大气和水体长距离迁移,因此残留在环境中的PCBs会对人类健康和整个生态系统构成持续威胁[1]。所以有必要开发快速监测和定量的检测方法。

目前检测海洋中PCBs的传统方法主要有高效液相色谱法和气相色谱-质谱法联用[2]。样品预处理复杂、实验周期长、成本高等缺点限制了其现场的应用。表面增强拉曼光谱(surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS)是一种新兴的化学分析技术。该方法因其极高的灵敏度、“指纹”特性和受水体影响小等优势在原位探测痕量污染物和结构分析等方面引起了人们的广泛关注[3-4]。如用β环糊精来修饰基底探测PCBs，灵敏度可以达到10-7mol·L-1[5]。利用修饰目标物的方法实现间接检测[6]。

但是对于分子在增强基底上的吸附特性迟迟没有统一的定论。研究人员最常利用密度泛函理论(density functional theory，DFT)研究分子在金属纳米材料表面的吸附特性[7-8]。如PCB52的一侧苯环可以嵌入环糊精的空腔且形成稳定的吸附构型[9]。DFT方法用于对比研究PCB52吸附在不同银原子簇上的拉曼光谱、吸附构象和增强因子，得出拉曼增强源自于Cl—Ag键的电子转移共振放大[10]。实际海水中PCBs种类繁多，结构极其相似，其自身在增强基底上的吸附差异最终会影响SERS峰的峰强和峰形，给定性定量分析造成巨大的困难。金纳米颗粒作为经典SERS增强基底，在与PCBs分子的吸附规律以及吸附差异方面鲜有人研究。所以探究不同结构的PCBs分子在金表面的吸附特性规律对海洋环境现场检测和定性定量分析具有重要的理论意义，有望推广应用于海洋中广泛存在的芳烃污染物上。

本文以金溶胶作为SERS增强基底，对海洋中常见的结构相似的4,4’-二氯联苯(PCB15)、2,4,4’-三氯联苯(PCB28)、2,2’,4,4’-四氯联苯(PCB47)和3,3’,4,4’-四氯联苯(PCB77)进行了SERS探测及其吸附特性研究。通过对比分子结构并分析特征峰位的差异，并辅以DFT计算，探究PCBs的SERS光谱规律。然后建立PCBs-Au吸附模型探究分子结构对吸附形态的影响。最后对系列浓度PCBs进行光谱探测，分析吸附差异给SERS定量带来的影响，为未来现场快速定量检测海洋环境中的PCBs提供研究基础。

1 实验部分

1.1 试剂与材料

氯化金四水合物(含金量47.8%)，柠檬酸三钠(99.0%)，氯化钠(99.0%)，甲醇(分析纯)均从国药集团化学试剂公司(上海)购买。4,4’-二氯联苯(PCB15，99.9%)、2,2’,4,4’-四氯联苯(PCB47，99.0%)和3,3’,4,4’-四氯联苯(PCB77，99.0%)购于Dr.Ehrenstorfer公司(德国)，2,4,4’-三氯联苯(PCB28，99.8%)购于Sigma-Aldrich生命科学公司(美国)。

1.2 金纳米溶胶的制备

金纳米溶胶在Frens方法的基础上修改制备[11]。将30 mL，浓度为1.6 mmol·L-1的氯金酸溶液加热至沸腾，在搅拌下(600 r·min-1)一次性加入10 mL，浓度为5.4 mmol·L-1的柠檬酸钠溶液，持续加热搅拌10 min，溶液颜色会从最初的蓝紫色变为紫红色。然后降低转速至360 r·min-1，温度设定为140 ℃，50 min后停止加热搅拌，自然冷却至室温后4 ℃避光保存。用紫外-可见分光光度计(CHK-26813，Jinkai)测试溶胶吸光度，用扫描电子显微镜(S4800，Hitachi)表征纳米粒子形貌，设定加速电压为20 kV，发射电流为8.2 μA。

1.3 光谱采集与处理

本文中提供的所有拉曼光谱实验数据，均以中心波长为785 nm的半导体激光器(ADR-1805，Sfolt)作为光源，“Y”形探头(RPB，InPhotonics)收集散射信号。采用便携式拉曼光谱仪SEED3000(Oceanhood，4 cm-1)采集光谱数据。通过对固体直接采集获得常规拉曼光谱，到样功率100 mW，积分时间5 s。SERS光谱检测时取一定量的PCBs溶液与浓度为5 mol·L-1的NaCl溶液混合，目的是调整待测液盐度模拟海洋环境。然后再与金溶胶混合(v/v=2∶3)进行SERS检测。到样功率200 mW，积分时间10 s。

1.4 DFT计算

在优化分子结构和计算真空拉曼时选择B3LYP/6-31+G(d)进行计算。在优化PCBs-Au体系和计算相应频率时，对Au原子的计算采用基组lanl2dz，其余原子的计算依旧采用6-31+G(d)基组。计算最终可以得到分子的拉曼频率，并选用矫正因子0.974 8进行了全谱矫正。

振动基频的归属采用势能分布(potential energy distribution，PED)计算方法。该方法对具体的分子首先选取适当的内坐标,按照分子所属的点群进行简正振动的对称分类，构造每个对称类的对称坐标,并且求出变换矩阵U。把这些必要的数据输入PED程序之后，最终得到振动基频的贡献大小，体现在光谱中就是某一个特征峰是多个振动模式耦合而成，每一个振动模式所占比用贡献度(单位：%)表示。

2 结果与讨论

2.1 PCBs结构差异在拉曼光谱中的体现

本文在对四种PCBs固体进行检测的同时，计算了各自的空间结构和振动模式。分析了结构差异在拉曼光谱中的体现，为更好的区分检测PCBs奠定基础。结果如图1所示(具体峰位和振动归属见表1)，四种物质的取代氯依次增加，其中PCB15与PCB28为对称和非对称取代，PCB47与PCB77为对称取代，区别在于是否处于桥键邻位，基本能够代表低氯联苯物质特性。四种多氯联苯共性特征峰，包括桥键伸缩振动，出现在1 290 cm-1位置附近，代表苯环伸缩振动的1 595 cm-1振动峰位置基本相同，典型的环呼吸振动分布于1 000 cm-1附近。

图1 四种PCBs的计算和实测拉曼光谱Fig.1 The calculated and experimental Raman spectra of PCBs

表1 四种PCBs的计算、实测拉曼和计算、实测PCBs-Au峰位及振动归属Table 1 Calculated,experimental normal Raman of PCBs and PCBs-Au vibrational frequencies and vibration assignment

续表1

同时由于氯原子数量以及取代位置的不同，在拉曼谱上也体现出了较明显的差异。有两个取代Cl的PCB15的轴对称结构使其拉曼振动模式成对、对称出现并最终耦合表现为一个振动峰，所以在拉慢光谱中PCB15特征峰数量比其他三种联苯明显更少。而PCB28相较于PCB15在桥键的邻位上多出一个Cl原子，分子对称性的破坏使振动态之间的耦合度减小，拉曼峰更为复杂。例如，在400和554 cm-1出现了表示HCCC面外弯曲和环扭曲的振动峰，1 145，1 182，1 238和1 373 cm-1处出现了HCC面内弯曲振动峰。并且在1600 cm-1附近出现劈裂，表明PCB28两个苯环出现不对称伸缩。PCB47相较于PCB15在桥键的两侧邻位各多出一个取代氯，并且同侧苯环上这两个Cl原子不相邻，致使C—Cl键和C—H键振动进一步多样化，在400～900和1 100～1 500 cm-1波数范围内不仅出现面内伸缩振动(400和684 cm-1)，还有面内、面外弯曲振动(829，1 491和481 cm-1)。PCB77同样是四个取代氯，但是其位置与PCB47不同，从邻位换成了间位，两个C—Cl键的靠近使其伸缩振动变得更加明显，如437，560，672和859 cm-1位置。

随着取代氯数量的增加，C—Cl键和C—H键振动逐渐增强；C—Cl键位置距离越远，C—H，C—Cl以及苯环振动越复杂，这为从光谱角度区分结构相似的多氯联苯提供了理论依据。

2.2 PCBs分子在金表面的吸附能力

研究发现SERS特征峰位和形状变化与其在基底表面的吸附状态有关，研究分子吸附特性有助于明确SERS作用机理，定量分析更准确。

四种PCBs的SERS光谱漂移最为明显的是桥键振动峰和环伸缩振动峰(图2)。如PCB28的桥键特征峰从1 288 cm-1红移至1 264 cm-1，环伸缩峰位从1 596 cm-1红移至1 569 cm-1，这是由于分子吸附在金基底上后，发生了电子转移所致[10]。但是PCB47的桥键振动峰从1 289 cm-1蓝移至1 319 cm-1，是因为PCB47桥键上的电子云密度增加使键级降低导致[12]。

图2 PCBs的计算和实测SERS光谱(a)：PCB15；(b)：PCB28；(c)：PCB47；(d)：PCB77Fig.2 The calculated and experimental SERS spectra of PCBs(a)：PCB15；(b)：PCB28；(c)：PCB47；(d)：PCB77

为进一步研究结构差异对吸附特性造成的影响，我们建立了PCBs-Au模型体系。由于分子与基底的相互作用仅与表面少数几个原子有关，综合考虑计算精度和时间耗费，模型中采用Au原子簇来模拟金纳米球表面。为了更好地理解四种PCBs与金原子簇的不同结合行为，对四种PCBs-Au复合物各自的结合能进行了比较。结合能计算公式如式(1)

ΔE=EPCBs-Au-(EPCBs+EAu)

(1)

式(1)中，EPCBs，EAu和EPCBs-Au分别表示PCBs，Au簇和PCBs-Au复合物的能量。计算结果显示它们的结合能分别为-6.46 kcal·mol-1(PCB15)，-3.01 kcal·mol-1(PCB28)，-0.31 kcal·mol-1(PCB47)和-1.95 kcal·mol-1(PCB77)。结合能的绝对值越大意味着分子与基底结合能力越强，显然最容易吸附在金表面的是PCB15，然后依次是PCB28和PCB77，最难吸附的是PCB47。这将直接影响在SERS检测过程中灵敏度以及线性规律范围，后续会进一步讨论。

2.3 PCBs分子在金表面的吸附形态

四种多氯联苯吸附行为的差异还需归结到其各自结构上来。对四种吸附模型的拉曼振动频率进行计算，结果如图2所示。计算与实测SERS光谱能够较好的吻合。四种多氯联苯在1 300和1 600 cm-1位置附近的峰与实测共性特征峰基本重叠，表示环伸缩的峰均发生了红移，证明PCBs通过π轨道吸附。吸附模型显示Au簇位于PCBs一侧苯环C—C顶部的桥接位置，并产生不同数量的理论吸附构形(图3)。分子吸附时靠近基底的苯环与金表面呈现固定的角度(PCB15-Au：76.64°，PCB28-Au：77.77°，PCB47-Au：75.71°，PCB77-Au：76.52°)，金簇边缘反应特性导致此构型比苯分子平行于金簇表面堆叠的构型更稳定[13]。这些角度虽有差异但总体相近，说明Cl取代的差异对于分子吸附时的方向影响有限。因为PCB15分子结构具有高度轴对称性，所以类似的具有相同结合能的理论结合位点还有三个。PCB28的结合位点减少到3个。PCB47与PCB77分子在PCB28结构的基础上桥键邻位或间位再次增加了一个Cl原子，所以均只剩下两个结合位点。

图3 PCBs在金表面的吸附形态(a)：PCB15；(b)：PCB28；(c)：PCB47；(d)：PCB77Fig.3 Adsorption configuration of PCBs on gold surface(a)：PCB15；(b)：PCB28；(c)：PCB47；(d)：PCB77

进一步通过四种物质吸附前后苯环二面角大小以及变化量(表2)的对比来分析吸附行为与空间位阻的内在规律。体积较大的氯原子进行取代会使其自由旋转受到限制，邻位的氯原子会增大旋转的空间位阻效应，最终体现在联苯二面角上。自由状态下，PCB15二面角为39.96°，与此相近的还有PCB77(39.79°)。PCB28的二面角增大到57.57°。PCB47的二面角最大为98.06°，接近垂直。这与位阻效应理论得出的结果相符，PCB15和PCB77的位阻程度较小，其次是PCB28，位阻程度最大的是PCB47。在吸附后，二面角均有不同程度的减小，变化最小的是PCB77(减小了1.98°)，变化最大的是PCB47(减小了22.38°)，几乎相差11倍，原因是PCB47较大的空间位阻会使分子刚性化，这一特性会增加吸附难度，间接解释了PCB47的结合能最低，结合能力最弱的结论。据此证明吸附行为会导致位阻效应减小，进而表现为苯环二面角度降低趋势。真空下分子位阻效应越大，吸附行为对二面角的改变量就越多，同时也意味着吸附困难增大，这与结合能的计算结果吻合。

表2 PCBs吸附前后苯环二面角以及对应的变化量Table 2 The dihedral Angle of benzene ring before and after adsorption of PCBs and the corresponding changes

通过对结合能、吸附形态、空间位阻、二面角等方面的分析，结果表明：取代氯的增加和取代位置的差异会影响PCBs分子吸附在金基底上的位点，取代氯越多且越分散，分子吸附在金表面的能力就越弱，可能存在的吸附形态就越少。同时吸附也会受分子苯环二面角的影响，这一现象在邻位取代的联苯分子上尤为明显。邻位取代氯的增多使位阻效应依次增加，分子逐渐刚性化最终难以与金表面结合。而大部分的SERS信号是由吸附在“热点”区的少量分子产生的，“热点”区域有限，推测吸附能力强的分子具有较高的检出浓度。

2.4 吸附特性对光谱定量分析的影响

如上文所述，多氯联苯吸附特性会影响其在SERS检测过程中的表现，为了直观比较吸附特性对PCBs的定量检测的影响程度，本文对海洋模拟液不同浓度的PCBs进行了SERS光谱检测与定量分析。

图4为不同浓度的PCBs溶液典型SERS光谱，图5为SERS峰强与浓度的定量关系曲线。虽然化学吸附导致SERS峰位与拉曼峰相比有十几个波数的漂移，但仍能够通过振动分析与峰位归属进行匹配(详见表1)。

图4 梯度浓度的PCBs溶液典型SERS光谱(a)：PCB15；(b)：PCB28；(c)：PCB47；(d)：PCB77Fig.4 Typical SERS spectra of PCBs solution with different concentration(a)：PCB15；(b)：PCB28；(c)：PCB47；(d)：PCB77

图5 特征峰强随PCBs浓度变化关系(a)：PCB15；(b)：PCB28；(c)：PCB47；(d)：PCB77Fig.5 The relationship between Raman intensity and PCBs solution concentration(a)：PCB15；(b)：PCB28；(c)：PCB47；(d)：PCB77

当PCB15浓度低至1 nmol·L-1时，仍能清晰地分辨出1 087和1 579 cm-1两个特征峰，对这两个峰的强度和浓度关系进行拟合。结果表明在浓度为1～16 nmol·L-1范围内，峰强随浓度的增加快速递增，峰强与浓度呈良好的线性关系，相关系数R2分别达0.998和0.999。当浓度在16～30 nmol·L-1范围，谱峰强度增长减缓，30 nmol·L-1之后特征峰强趋于平稳，说明PCB15在此浓度范围中接近饱和吸附。PCB28，PCB47和PCB77的最低检出浓度分别为2，4和8 nmol·L-1，三者对应的线性浓度范围分别为2～32，4～50和8～50 nmol·L-1，拟合相关系数均在0.985以上。与PCB15相比，检出浓度升高，线性范围也增大，四种多氯联苯检测数据明显表示出与吸附行为相关的特性。由于PCB15与金表面的结合能力较强，即使被测液浓度低至1 nmol·L-1也能清晰地被探测到。同时在30 nmol·L-1浓度左右几乎达到饱和，也间接说明了相同浓度下PCB15在金表面的吸附能力是四者中最高的。由此印证了吸附位点受限制，在由联苯作为主体框架结构前提下，氯原子数越多越难吸附在金表面，越难达到吸附饱和的结论。

为证明实验结果的合理性和准确性，用加标回收进行验证，计算公式如式(2)

(2)

式(2)中，P为回收率，c1为测定浓度，c2为标准浓度，每个浓度的加标回收测试重复4次然后取平均，具体结果列于表3，此方法的回收率在87.9%～107.9%范围内，说明此方法对于PCBs的定性定量检测的准确性较好，满足现场分析的需求。

表3 PCBs的加标回收测试结果Table 3 Test values of labeled recovery test of PCBs

3 结 论

利用SERS技术结合DFT计算，首先探讨了四种PCBs结构差异在拉曼光谱中的体现，实验结果表明，四种PCBs的共性特征峰来自于环呼吸振动(CCC弯曲)、桥键伸缩振动和苯环伸缩振动，随着Cl原子数目增加，C—Cl键和C—H键的振动逐渐增强，C—Cl键越分散，其振动越复杂。然后建立了PCBs-Au吸附模型，分析分子在金表面的吸附特性。确立了物质的吸附能力由高到低依次为PCB15和PCB28，然后是PCB77，最低是PCB47，Cl原子的增加减少分子在金表面的吸附构型。位阻效应大的分子会阻碍其与基底的结合。最后探究了海洋环境下吸附特性对SERS定量分析的影响。各自的吸附能力决定了其饱和浓度和检出浓度，吸附能力最强的PCBs率先达到饱和且检出浓度最低。