赵兵令 汪令 王红志 王露 李华声 宋玉卓,3 冯金民 车晓菲*

1.河北维尔利动物药业有限公司 050000

2.河北省中兽药产业技术研究院 050000

3 河北省功能性添加剂技术创新中心 050000

黄连是毛茛科植物黄连、云连或三角叶黄连的干燥根茎，三者分别称为“川连或味连”“云连”“雅连”。主产地有四川、湖北、重庆、贵州、云南等地。其始载于《神农本草经》，被誉为上品，其性寒、味苦，归心、脾、胃、胆、大肠经，具有清热燥湿、泻火解毒的作用；现代药理学表明，对抗菌和抗炎具有“中药抗生素”的赞誉，并且黄连还有降血糖、抗肿瘤、镇静催眠及对心血管系统的影响。黄连主要有效成分为小檗碱、巴马汀、黄连碱、表小檗碱和药根碱等生物碱类物质。黄连作为常用中药，其不仅为人类临床应用及健康做出重要贡献，而且也是畜禽疾病防治的重要物质基础。比如“白头翁口服液”“黄连解毒汤”以及“四黄止痢颗粒”，主要功能为清热解毒，凉血止痢，研究表明其方剂用于治疗家禽肠道感染性疾病有很好的效果。然而处方中君药黄连起主要药效作用且市场价格较贵。随着国内对黄连的需求量与日俱增，并且黄连对生长环境要求苛刻、生长年限长、单位面积产量低。在经济利益的诱惑下，黄连被大量过度采挖，导致其野生药材资源锐减，越来越多的兽药企业因节约成本不投、少投、投劣质黄连或黄连须替代黄连，原材料的差异对产品的稳定性、临床效果存在很大隐患。随着我国畜禽饲用产品限抗、减抗、禁抗政策的颁布实施，中药替抗已成为目前畜牧行业的研究热点，相关政策指出中药资源产业化过程中所产生的非药用部位及副产物是开发替抗类饲用产品潜在的重要原料。目前黄连只以其根茎入药，非药用部位须根、茎和叶作为废料遗弃，造成资源的严重浪费，然而关于黄连不同部位通过薄层色谱法定性鉴别以及高效液相色谱法定量检测双重控制质量标准的报道鲜有显示。本文对药用部位黄连以及非药用部位4 种主要生物碱活性成分的薄层鉴别、含量进行比较分析，由此为黄连相关的中药制剂能否用非药用部位替代提供参考和理论依据，并且为黄连非药用部位合理利用和资源开发，以期为中药资源产业的提质增效和绿色发展提供支撑，为饲用抗生素的有效替代提供途径。

1 材料与方法

1.1 仪器电热恒温水浴锅(天津泰斯特DK-98-11)；超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司生产KQ5200B)；电热鼓风干燥箱(北京市永光明医疗器械101～3AS)；电子天平(岛津菲律宾厂AUW120D)；硅胶G板，青岛海洋化工厂分厂生产；美国安捷伦Agilent1260-II 高效液相色谱仪。

1.2 试剂盐酸小檗碱、盐酸黄连碱、巴马汀、表小檗碱（中国食品药品检定研究院，批号110713-201814,110745-201978,110732-201913,110765-202035）；甲醇、乙腈、磷酸均为天津市康科德试剂有限公司产品，色谱纯。环己烷、乙酸乙酯、异丙醇、三乙胺、磷酸二氢钾、十二烷基硫酸钠均为科密欧化学试剂有限公司产品，分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理黄连3 批样品均采集于湖北利川，取健康整株黄连分别将每株的根茎、须根、茎和叶进行分离，将上述处理好的材料分别置于55℃～60℃干燥烘箱内烘干至恒重，粉碎二号筛，获得不同部位黄连材料粉末，室温密封保存待用。

1.3.2 薄层色谱鉴别按照中华人民共和国《兽药典2020版》分别取黄连各部位粉末0.25g，加甲醇25mL，超声处理30min，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取黄连对照药材0.25g，同法制成对照药材溶液。再取盐酸小檗碱、盐酸黄连碱、巴马汀、表小檗碱对照品，加甲醇分别制成每1mL 含0.5mg 的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法 (通则 0502)试验，吸取上述6 种溶液各1μL，分别点于同一高效硅胶G薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯-异丙醇-甲醇-水-三乙胺（3 ∶ 3.5 ∶1 ∶1.5 ∶O.5 ∶ 1）为展开剂，置用浓氨试液预饱和20min 的展开缸内，展开，取出，晾干，置紫外光灯 (365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显4 个以上相同颜色的荧光斑点 ;对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

1.3.3 高效液相色谱检测按照中华人民共和国《兽药典2020 版》十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.05moI/L 磷酸二氢钾溶液 (50 :50)(每100mL 中加十二烷基硫酸钠0.4g，再以磷酸调节pH 值为4.0)为流动相；检测波长为345nm，流速1.0mL/min，柱温25℃，进样量10μL。取盐酸小檗碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL 含90.5μg的溶液备用。取本品粉末 (过二号筛)约0.2，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇-盐酸(100:1)的混合溶液50mL，密塞，称定重量，超声处理(功率50W，频率40kHz)30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液2mL，置10mL 量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得 。

1.3.4 数据分析高效液相色谱检测检测结果用（Means±SE）表示，用SPSS19.0 软件进行单因素方差分析，P ＜0.05 有意义。

2 结果

2.1 黄连不同部位外观、形状本实验样品采于湖北利川，将健康整株黄连分为黄连叶、黄连茎、黄连跟、黄连须四个部分（如图1），经专业药材鉴定师鉴定为毛茛科植物味连，并且其外观和形状与刘芳报道相一致。

图1 黄连不同外观、形状

2.2 薄层色谱鉴别如图2 所示，黄连不同部位四种生物碱均能显示荧光斑点，而黄连叶表小檗碱荧光斑点较浅，且黄连根四种生物碱荧光斑点最明显。通过比较黄连不同部位荧光斑点的大小，未呈现出明显的规律性。

图2 黄连不同部位薄层鉴别

2.3 高效液相色谱含量测定如图3 所示，通过高效液相色谱含量测定与黄连根相比，小檗碱含量分别是黄连叶的4.58 倍、黄连茎的4.82 倍、黄连须的4.01 倍，差异均显著（P ＜0.01）；巴马汀含量分别是黄连叶的11.3 倍、黄连茎的13.17 倍、黄连须的9.25 倍，差异均显著（P ＜0.01）；黄连碱含量分别是黄连叶的16.77 倍、黄连茎的3.09 倍、黄连须的1.22 倍，差异均显著（P ＜0.01）；表小檗碱含量分别是黄连叶的60.57 倍、黄连茎的7.89 倍、黄连须的1.25 倍，差异均显著（P ＜0.01）；由此可见，黄连各生物碱含量明显高于其他部位，并且黄连四种生物碱小檗碱含量最高。

图3 黄连不同部位含量检测

3 讨论

中药及其复方残留低、不易产生耐药性、质量难于量化控制以及非药用部位可饲用等特点，建立完善的质量标准控制体系和评价体系，把控中药制剂产品的稳定性、药材副产物的合理利用成为急需待解决的问题。生物碱类是黄连最主要的药效成分，包括黄连碱、巴马汀、小檗碱、表小檗碱等。本研究通过薄层色谱鉴别结果显示黄连各部位生物碱荧光斑点清晰，且黄连各生物碱荧光斑点最大；结合高效液相色谱含量测定结果可知与黄连相比非药用部位黄连叶、黄连茎、黄连须中4 种生物碱含量存在明显变化，该结果与文献报道的黄连不同部位总生物碱含量大小顺序依次是根茎 ＞ 须根＞ 叶片结果相吻合。并且本研究结果显示黄连的4 种生物碱含量最高与文献报的黄连药材生物碱含量顺序为小檗碱＞黄连碱＞巴马汀＞表小檗碱＞非洲防己碱＞药根碱结果相一致。此外相关研究表明在黄连生长过程中，其植株的生物碱随着生长不断向根茎转移，该结论与本实验结果存在一定出入，可能不同品种、季节对黄连生物碱的分布存在一定的影响。而中药作用的物质基础是其所含有的化学成分，黄连的广泛应用与其所含各种生物碱的药理作用存在密切关系，并且黄连的药理作用并不是某单一生物碱作用的结果，比如黄连中小檗碱抗炎作用较强，但是黄连水提液的最低抑菌能力要强于小檗碱，由此表明黄连中含有其他抗菌或对抗菌有协同作用的成分 。所以只有对其主要生物碱的含量进行全面控制，才能保证药材的质量。此外有资料显示黄连其须根、茎、叶等可以作为黄连的代用品 。结合本实验研究结果这为加强中兽药在动物养殖中的实践应用，开发替抗类饲用产品，有效推动我国畜牧养殖行业发展提供很好的保障。

黄连非药用部位各生物碱具有一定的综合利用价值，能否完全或部分替代药用部位临床效果有待于进一步确定，同时也为黄连非药用部位作为饲料添加剂开发奠定了基础。