刘伟，李淼，李桂祥，董晓民，高晓兰，张安宁

（山东省果树研究所，山东 泰安 271000）

桃（Prunus persica）是蔷薇科桃属的重要果树之一，中国为桃最为重要的发源地，种质资源丰富，类型多样［1］，目前已在北京、南京和郑州建立了国家级的桃种质资源库［2］。山东省是我国桃的重要产区之一，存在很多地方品种，其中最具代表性的是肥城桃、青州蜜桃、梁山蜜桃、蒙阴蜜桃等［3］。随着我国桃育种技术的进步，优良桃品种的选育和推广栽培进展迅速，桃种质资源的交流愈发频繁，一些经济性状良好的新品种取代了传统的地方品种［4］，导致地方品种栽培面积急剧萎缩，种质资源流失严重。而地方桃种质资源具有突出的优良性状，是育种的重要基因库，因此，为防止地方品种资源的进一步流失，收集、鉴定、评价地方桃种质资源成为山东省桃品种资源和育种工作的重要课题之一。

传统的形态学特征鉴定等虽然方法简单，但极易受环境影响，同时需要专业的背景知识，实际应用受到很大限制。近年来，以PCR为代表的分子标记技术广泛应用，为桃种质资源的鉴定、亲缘关系的遗传分析等提供了良好的技术手段。其中，SSR（simple sequence repeats，简单序列重复）标记呈现出多态性良好、检测方便、稳定性高等特点［5］，尤其是SSR荧光标记技术，可进行大批量样本的精准检测，在苹果［6］、葡萄［7］、梨［8］等果树的研究中发挥了重要作用。

目前，SSR荧光标记技术已经成为桃属植物遗传多样性和亲缘关系评价的重要方法之一［9－11］，但基于该项技术构建山东省桃种质资源身份证并进行种质鉴定的相关研究还未见报道。构建山东地方桃种质资源身份证，不仅有利于资源的合理利用和保护，而且能够促进未来育种工作的进一步发展。因此，本研究通过筛选得到的多态性良好的10对SSR引物进行PCR扩增，利用SSR荧光标记毛细管电泳技术对扩增带型进行分析，结合带型编码，构建了60份山东省桃种质资源的分子身份证，并进行聚类分析，旨在从分子水平对山东省桃种质资源的遗传多样性和亲缘关系进行探讨，为资源的合理保护、正确评价和科学育种提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2019年7月至2020年7月在山东省果树研究所进行，所用60份桃种质材料（表1）采自山东省果树研究所桃种质资源圃、肥城桃园艺所及青州市、梁山县桃产地。每个品种选取幼嫩茎尖叶片，迅速液氮冷冻，带回实验室置于－80℃冰箱中保存备用。

表1 试验所用桃种质材料名称及类型

1.2 SSR引物合成及筛选

采用HiPure Plant DNA Mini Kit（Magen）提取桃茎叶的基因组DNA，纯化后克隆筛选，建立SSR富集文库，从中开发并设计分布于桃16个连锁群的30对引物。随机选择4份样品（1，7，41和43）的总DNA，用30对引物进行PCR扩增，经SDS－PAGE分析扩增条带，筛选出扩增条带清晰、稳定、多态性高的10对引物用于样品扩增。正向引物的5′端加1个FAM荧光标记，所用引物均由通用生物系统（安徽）有限公司合成（表2）。

表2 引物信息

1.3 DNA提取以及PCR体系

采用HiPure Plant DNA Mini Kit（Magen）提取样品总DNA。用1%琼脂糖凝胶电泳和微量紫外分光光度计检测DNA质量和浓度，并稀释至50 ng·μL－1，－20℃保存备用。SSR－PCR反应体系（共25μL）：ddH2O 19.3μL，dNTP（2.5 mmol·L－1）1μL，Taq酶10×Buffer 2.5μL，正、反向引物（20 μmol·L－1）各0.5μL，DNA模板1μL，Taq酶0.2 μL。PCR扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，54℃退火35 s，72℃延伸40 s，35个循环；72℃延伸3 min。

1.4 SSR荧光标记毛细管电泳检测

对PCR扩增产物进行纯化，将甲酰胺与分子质量内标按100∶1的体积比混匀后，取15μL加入上样板中，再加入1μL稀释10倍的扩增产物，毛细管电泳仪ABI3730XL进行电泳分析。待电泳结束后，利用GeneMarker中的Fragment（Plant）片段分析软件对毛细管电泳的原始数据进行分析，将分子质量内标Marker的位置与各样品峰值的位置做比较，读取片段大小。利用POPGENE 32软件分析数据，获得引物扩增的等位基因数、扩增带型及样品在不同SSR位点的基因多样性、多态性信息含量和香农指数。

1.5 分子身份证构建

利用10对引物对60份样品进行扩增，得到各样品的指纹数据，将指纹数据转换为数字编码，即分子身份证。转换方法如下：将每对引物在某一样品上扩增出的每一种带型用阿拉伯数字1～9编码，为保证每一种带型只占一位数字，当带型数大于9时，分别用a、b、c代表第10、11、12种带型，依此类推，无带用0表示；按照引物扩增带型数由少到多的顺序，将每个样品在10对引物上的扩增带型编码串联起来，即得到每个样品以10位数字或字母表示的分子身份证［12］。

1.6 聚类分析

用NTSYS－pc Version 2.1软件对SSR位点进行分析，以Dice相似系数采用非加权平均法（UPGMA）对60份桃种质进行聚类分析。

2 结果与分析

2.1 毛细管电泳结果

如表3所示，利用10对SSR引物对60份桃种质进行扩增，共检测到58个等位位点，每对引物得到的等位位点在2～8个之间，平均每对引物5.8个；共扩增得到116个带型，每对引物得到的带型在3～18个之间，平均每对引物11.6个，扩增片段长度在109～270 bp之间。图1为引物对P29对55和56号样品的扩增带型分析结果。10对引物的多态性信息含量在0.2044～0.7378之间，平均为0.5699；Nei’s基因多样性指数在0.2311～0.7692之间，平均为0.6103；香农指数在0.3927～1.6403之间，平均为1.2266。表明10对SSR引物为高多态性引物［13］，能够有效显示出60份桃种质的遗传多样性。

表3 10对SSR荧光引物对60份山东桃种质的扩增结果

图1 引物P29对不同样品扩增产物的带型分析

2.2 分子身份证编码

按照表2所示的引物顺序，将每对引物在不同样品上扩增得到的带型按照由少到多的顺序排列并将其编码进行串联，即得到60份桃种质资源的分子身份证（表4）。对应位置编码相同则表明该引物在不同样品上得到了相同的扩增带型。结果（表5）表明，在供试的60份山东地方桃种质资源中，得到了44个不同类型的分子身份证代码，其中，基地3号肥桃、基地5号肥桃、基地4号肥桃、基地7号－肥桃、基地6号－肥桃与香肥桃共享同一分子身份证代码；肥17号、肥47、肥51－82、肥51－28与大叶白里肥桃共享同一分子身份证代码；5311与大叶红里肥桃共享同一分子身份证代码；梁山蜜桃4号、梁山蜜桃3号、梁山蜜桃2号、梁山蜜桃1号分子身份证代码相同；中华寿桃和寒露蜜分子身份证代码相同；珍品王桃和蓬仙15分子身份证代码相同；秋彤和肥39分子身份证代码相同，但这两个品种有待于进一步验证。通过分子身份证代码，将供试的60份山东地方桃种质进行了合理的区分。

表4 10对SSR引物的扩增带型

表5 供试60份桃种质的分子身份证代码

2.3 聚类分析

根据10对SSR引物对60份山东桃种质的扩增数据，以Dice相似系数采用UPGMA聚类，得到桃系统关系树，如图2所示。可以发现，在遗传相似系数为0.46时，可以将60份山东地方桃种质资源分为5组：第Ⅰ组包括3个品种，分别为1、2号和32号；第Ⅱ组24个品种，包含17个肥城桃品种，并聚为一支，其中，19、20、21、22、23、30号亲缘关系较近，24、29、31、35号亲缘关系较近，26、27、33号亲缘关系较近，说明肥城桃群体基因组相对保守，受外来品种基因组渗入影响较小；第Ⅲ组包含9个桃品种，分别是4、6、40、16、17、54、39、38、36号，其中，4号和6号亲缘关系较近，16号和17号亲缘关系较近；第Ⅳ组包含22个桃品种，其中，48、49、50、51、52、53、55、57号为8个美国遗传背景的桃品种，与山东本地桃背景相差较大，区分明显；第Ⅴ组包含2个品种，分别是25号和56号，这两个品种可能存在其他基因组的渗入，与其他桃品种相差较大。可见，聚类分析结果与分子身份证代码分析结果相符，共享同一分子身份证代码的品种在系统关系树中遗传相似系数相同。

图2 基于10对SSR引物的60份山东桃种质聚类分析结果

3 讨论

SSR标记技术兼顾高准确性和高稳定性。目前，SSR扩增产物的检测主要有银染技术和荧光标记技术2种，银染技术分析效率较低，无法进行批量操作，且有害人体健康；荧光标记技术解决了银染技术存在的种种问题，更适合多样本操作，同时具有更高的灵敏度和准确性。郝晨阳等［14］对银染技术和SSR荧光标记技术进行了详细对比，证实SSR荧光标记技术处理效率更高，更加经济实惠。鲁敏等［15］对40份梨种质资源的研究也表明，SSR荧光标记技术得到的数据重复性和准确性均较高。结合本试验结果，SSR荧光标记技术能够准确高效地对扩增带型进行大小判别。

近年来，桃种质资源的SSR引物数量增长迅速［16］；尽管桃基因组相应染色体上都标记有大量的SSR位点信息，但实际研究中可用的SSR数量仍然较少，因此，相应研究将有助于桃目的基因定位、种质资源鉴定以及遗传进化等课题的开展［17］。叶宇芸等［18］通过NCBI数据库的ESTs信息开发了20对SSR引物，并用于对成都平原主栽的40份桃种质进行分子身份证构建，得到平均等位基因数3.4个；李雄伟等［19］通过48个SSR标记对国内外669份桃品系的遗传多样性进行分析，筛选出16个多态性高的标记，可用于构建基于SSR分子标记的桃种质分子指纹数据库；陈霁等［20］利用16对SSR引物对42份观赏桃品种进行扩增，得到平均等位基因数7.75个。本研究通过10对SSR引物构建了60份山东桃种质的分子身份证，共检测得到58个SSR等位位点和116个扩增带型，平均每对引物得到SSR等位位点5.8个，扩增带型11.6个。

通常认为，当位点多态性信息含量＞0.5时，该引物即为高度多态性信息引物［21］。本研究中，10对SSR引物平均多态性信息含量为0.5699，其中多态性信息含量大于0.5的有8对，占比80%，充分说明本研究所采用的SSR引物多态性较高，能够有效地对60份山东桃种质进行鉴定。原因可能有两点：第一，本研究所用引物是从30对引物中二次筛选而来；第二，供试材料自身具备丰富的遗传多样性，从而使得引物的多态性信息含量升高。

迄今为止，SSR指纹图谱的研究结果通常以分子身份证［22］和品种聚类图［23］的形式呈现，二者各有特点。分子身份证是由品种指纹图谱数据抽象化而来，无法直观显示品种间的指纹信息；品种聚类图只能够通过遗传相似系数呈现品种之间遗传距离的远近，不能将品种区分开，也不能显示SSR多样性信息。本研究综合采用了分子身份证和品种聚类图两种形式，有效规避了两种形式的不足，两种形式所得结果一致，即共享同一分子身份证代码的品种在系统关系树中也具有相同的遗传相似系数。

不同研究采用的分子身份证构建方法亦有不同［24，25］，本研究采用的是数字（0～9）和字母（26个小写英文字母）相结合的方式，通过将引物扩增的带型按照由小到大的顺序排列并进行编码，得到各品种的分子身份证代码。本研究选取的10对SSR引物平均多态性信息含量为0.5699，具备良好的多态性，其中多态性信息含量数值高于平均值的有8对，理论上能够区分836个桃种质资源。本研究选取的60份山东桃种质均得到了合理的区分，得到的分子身份证信息可用于品种资源的鉴定和分类。

地方种质资源往往蕴含着高产、抗逆等优良性状，全面研究山东地方桃种质资源遗传多样性还需要进一步扩大地方桃种质资源的样品，同时结合形态学、细胞学等技术，多角度、多层面系统研究地方品种的遗传关系，从而为正确评价山东地方桃种质资源创新和育种实践提供理论支持。此外，随着人类活动和自然环境的影响，越来越多的桃种质资源遭到破坏甚至灭绝，因此，对山东地方桃种质资源进行广泛而有效地收集、保护、评价和利用已成为一项比较紧迫的任务。本研究初步构建了60份山东桃种质的分子身份证，今后将纳入更多种质进一步完善山东地方桃种质资源库。

4 结论

本研究采用SSR荧光标记毛细管电泳检测技术构建了60份山东桃种质的分子身份证，得到的SSR引物具备较高的多态性信息，将有助于山东地方桃品种资源的鉴定、遗传多样性评价、亲缘关系分析等各项研究工作的顺利开展。