陈磊 郭海萍 逄宇 刘光福 潘兆宝 韩守华 程娟 李姗姗

近年来，由非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)引起感染的患者明显增多，其中以脓肿分枝杆菌(Mycobacteriumabscessus)感染最为常见[1]。脓肿分枝杆菌是一种快速生长型NTM，主要引起肺部及皮肤软组织感染[2]，已有很多关于脓肿分枝杆菌在人与人之间进行传播，甚至引起院内感染的报道[3-4]。脓肿分枝杆菌对现有的大多数抗生素及经典的抗结核药物具有天然耐药性[5]，因此其引起的感染极难治疗。

最近的研究表明，3-氨甲基-4-卤代苯并噁唑类化合物GSK656作为一种结核分枝杆菌亮氨酰-tRNA 合成酶(leucyl-tRNA synthetase)的小分子抑制剂，可用于治疗耐多药结核病[6]。本研究团队的前期研究表明，GSK656对脓肿分枝杆菌具有较好的体外抑菌活性[7]。GSK656与其他抗菌药物，特别是与氨基糖苷类药物联合使用在治疗因脓肿分枝杆菌感染引起的疾病时是否具有协同效应，将为以GSK656为有效治疗方案的制定提供新的临床依据。本研究评价GSK656与氨基糖苷类药物——阿米卡星联合用药对脓肿分枝杆菌分离株的体外抑菌活性，为临床应用GSK656联合阿米卡星治疗脓肿分枝杆菌感染提供依据。

材料和方法

一、材料和仪器

1.临床分离株：脓肿分枝杆菌标准株(ATCC 19977)及30株分离株来自首都医科大学附属北京胸科医院菌株库。所有脓肿分枝杆菌分离株均已通过多位点序列分析，包括16S rRNA、hsp65、rpoB、16S-23S rRNA序列测定，在分析比对后鉴定菌株种类[8]。

2.培养基和抗菌药物：中性罗氏(Löwenstein-Jensen)培养基购自丽珠医药集团股份有限公司，抗菌药物粉剂阿米卡星购自美国Sigma-Aldrich公司，GSK656购自上海瀚香生物科技有限公司。采用无菌纯水溶解后通过无菌0.22 μm滤膜(爱尔兰默克密理博公司)过滤后备用。

二、实验方法

1. 主要检测指标：检测阿米卡星、GSK656对30株脓肿分枝杆菌的体外最低抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)、抑制50%受试菌所需的最低抑菌浓度(MIC50)、抑制90%受试菌所需的最低抑菌浓度(MIC90)。MIC50和MIC90可以反映药物的体外抑菌活性，数值越低，体外抑菌活性越强。

2. MIC测定：微量肉汤稀释法参照临床和实验室标准化研究所(Clinical and Laboratory Stan-dards Institute，CLSI)指南进行药物敏感性试验(简称“药敏试验”)[9]。取接种于中性罗氏培养基并培养3～7 d长势良好的脓肿分枝杆菌标准菌株(ATCC 19977)和30株分离株进行药敏试验。使用Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基对抗生素进行稀释，GSK656的浓度范围为0.008～8 mg/L，阿米卡星的浓度范围为0.125～128 mg/L。从罗氏培养基斜面上刮取菌落并制备成1个麦氏浓度的新鲜菌液，以1∶20比例稀释后接种于96孔微孔板中。30 ℃ 孵育72 h后，每孔加入含20 μl阿尔玛蓝和50 μl 的5%吐温-80混合液，以37 ℃孵育24 h后评估细菌生长状况。将阻止液体由蓝色变为粉红色的最低药物浓度判定为MIC值。本研究采用CLSI指南，将MIC≤16 mg/L定义为阿米卡星对脓肿分枝杆菌敏感，将MIC≥64 mg/L定义为阿米卡星对脓肿分枝杆菌耐药[9]；而对于GSK656，脓肿分枝杆菌的耐药基线值尚无报道。

3. 分级抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index，FICI)测定：联合药敏试验采用棋盘稀释法，根据各单药MIC结果确定联合药敏试验使用的药物浓度范围，将GSK656和阿米卡星分别进行倍比稀释，使其工作浓度分别为8×MIC、4×MIC、2×MIC、MIC、1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC、1/16 MIC。以30 ℃孵育72 h后，每孔加入含20 μl阿尔玛蓝和50 μl的5%吐温-80混合液，以37 ℃孵育24 h后评估细菌生长状况。记录两药联合使用时的MIC值，并计算FICI判断两种药物联合使用的效果。FICI计算方法：FICI=A药联合使用时的MIC/A药单独使用时的MIC+B药联合使用时的MIC/B药单独使用时的MIC。FICI≤0.5为协同作用，0.52为拮抗作用[10]。

结 果

一、GSK656与阿米卡星单独或联合使用对脓肿分枝杆菌的MIC情况

30株脓肿分枝杆菌分离株对各抗菌药物的MIC值见表1。对于阿米卡星，脓肿分枝杆菌的耐药基线值为≥64 mg/L。本研究中30株脓肿分枝杆菌分离株对阿米卡星的敏感率为100.0%(30/30)(表1，2)。GSK656单独使用时对30株脓肿分枝杆菌分离株的MIC50和MIC90分别为0.250 mg/L和2.000 mg/L，阿米卡星单独使用时对30株脓肿分枝杆菌分离株的MIC50和MIC90分别为8.000 mg/L和16.000 mg/L。当两种药物联合使用时，GSK656的MIC50和MIC90分别为0.125 mg/L和0.500 mg/L，为单独使用时的1/2和1/4，阿米卡星的MIC50和MIC90与单独使用时相同。

表1 30株脓肿分枝杆菌对GSK656和阿米卡星的MIC值分布情况(株)

二、GSK656和阿米卡星联合使用对脓肿分枝杆菌的FICI分布影响

GSK656和阿米卡星联合使用对30株脓肿分枝杆菌以无关作用为主(80.0%，24/30)，对5株(16.7%)产生了协同作用，仅有1株(3.3%)产生了拮抗作用(表3，4)。

表2 30株脓肿分枝杆菌分离株对GSK656和阿米卡星的MIC范围(mg/L)

表3 30株脓肿分枝杆菌对GSK656和阿米卡星单独和联合使用的MIC和FICI分布情况

表4 30株脓肿分枝杆菌对GSK656和阿米卡星单独和联合使用的MIC和FICI具体情况

续表4

讨 论

在过去的几年中，由NTM引起的感染患者例数快速增加[11-12]。由于缺乏明确的人与人之间传播的证据，由NTM引起的感染往往容易被忽视[13]。且由于其对大多数的抗生素天然耐药，对脓肿分枝杆菌感染的治疗非常困难[14]。目前的治疗方案推荐应用氨基糖苷类或大环内酯类抗生素进行治疗，然而仅有约1/3的患者在多种抗生素治疗后能够获得良好的疾病转归[11]。鉴于目前用于治疗的抗生素效果不佳，亟需新的药物或者药物组合来治疗因脓肿分枝杆菌感染引起的疾病。

目前的指南推荐使用大环内酯类联合氨基糖苷类或碳青霉烯类药物治疗脓肿分枝杆菌引起的肺部疾病[15]。氨基糖苷类药物在分枝杆菌引起的疾病的治疗中一直扮演着重要的角色。大多数氨基糖苷类化合物是由链霉菌属或小单孢菌属的放线菌产生的天然物质。氨基糖苷类化合物的杀菌原理主要是通过与细菌的30 S核糖体亚基结合，导致翻译过程不能正常进行，从而导致细胞死亡[16]。该类抗生素的特点是抗菌谱广，杀菌作用迅速，并能与其他药物产生协同作用。阿米卡星通常用于治疗由快速生长型分枝杆菌引起的严重感染，包括偶然分枝杆菌和脓肿分枝杆菌。然而，在快速生长的龟分枝杆菌和脓肿分枝杆菌中，由于核糖体操纵子单一拷贝的存在，其16S rRNA 1408位点的单一突变将导致高水平的阿米卡星耐药。突变频率已被证明高达10-5[16]。这表明当这些细菌大量存在时，氨基糖苷类药物不应作为单一药物使用。

作为替代疗法，一些新的抗结核药物用于NTM患者的治疗实现了治疗效果[17]。因此，进行体外(联合)药敏试验评估这些新的抗结核药物对NTM的MIC至关重要。GSK656是一种新的结核分枝杆菌亮氨酰-tRNA 合成酶的小分子抑制剂，它可以抑制亮氨酸修饰和蛋白质合成[6]。已有研究表明，GSK656对耐多药结核病和广泛耐药结核病的分离株均有较好的体外抑制效果[7]。目前，关于GSK656对NTM菌株的体外抑菌活性的研究结果较少。Li等[6]药代动力学研究结果证实，GSK656在小鼠模型中的生物利用度为11.12 h·μg·ml-1，高于本研究中大多数脓肿分枝杆菌分离株的MIC值。本研究结果表明，GSK656在体外具有良好的抗脓肿分枝杆菌活性。96.7%(29/30)的测试菌株MIC值≤2 mg/L，因而GSK656是一种潜在的抗脓肿分枝杆菌的药物。

阿米卡星是治疗脓肿分枝杆菌肺病的一种氨基糖苷类药物[13]。在本研究中，30株分离株对阿米卡星的敏感率为100.0%，且阿米卡星与GSK656的联合效应较好，16.7%表现为协同作用，80%表现为无关作用，仅3.3%表现为拮抗作用。从机制上看，GSK656是一种tRNA合成酶的抑制剂[6]，而阿米卡星的作用位点为16S rRNA[13]，两者在抑制蛋白质合成上可能有协同作用或相加作用。30株分离株中，仅有1株的联合药敏试验结果显示为拮抗作用，推测其拮抗作用可能是由于该菌株在传代培养的过程中，部分菌株对阿米卡星产生了耐药。

在体外药敏试验中，将阿米卡星与GSK656联合作用，可提供GSK656与常规抗脓肿分枝杆菌药物之间疗效的直接比较，为GSK656在临床的应用提供新的参考依据。本研究结果表明，当GSK656与阿米卡星联合使用后，GSK656对脓肿分枝杆菌的MIC50和MIC90较单独使用时出现明显降低，由于协同作用而减少的MIC可能有助于取得良好的预后，从而提高临床疗效，减少耐药的出现[11]。

本研究存在一定局限性。首先，体外确定的抗菌药物的活性可能不能预测体内的药效，特别是协同作用。其次，不良反应的发生是一个重要的问题，但在现有研究中无法获得此类信息。

综上所述，体外联合药敏试验结果表明，GSK656或GSK656和阿米卡星联合用药可能可以作为脓肿分枝杆菌治疗的替代方案，但结果仍需进一步的动物和临床试验加以验证。