三种茶叶的抑菌作用研究

2022-03-11宋军霞祁红兵

农产品加工 2022年4期

宋军霞，祁红兵，彭璐

（1. 岭南师范学院地理科学学院，广东湛江 524048；2. 岭南师范学院生命科学与技术学院，广东湛江 524048）

茶是我国的国饮，是天然的绿色饮料。我国是最早发现茶树和茶饮品的国家[1]。茶叶中的活性物质有白蛋白、维生素、无机盐、茶多酚、茶嘌呤碱、茶多糖等。茶叶生物碱具有兴奋、松驰平滑肌、助消化作用；茶多糖具有防物理辐射、抗凝血、抗血栓、降低血糖及增强免疫功能；茶多酚具有抗氧化、抗癌、抗菌、消炎，治疗痤疮等作用[2-3]。

有关报道中提出，6 种茶叶对牙龈卟啉单胞菌、变形链球菌、具核梭杆菌、中间普氏菌等口腔致病菌都有很好的抑制作用，绿茶效果最好，红茶效果最差[4]。也有试验指出六大类茶叶对金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌都有抑制效果，不发酵的绿茶和中等发酵程度的乌龙茶、黄茶和白茶抑菌效果较好[5]。由此可见茶叶抗菌谱广，抗菌效果很强且不易产生耐药性。茶叶的主要抑菌物质为茶多酚、茶黄素等物质。由于不同的制作工艺致使不同茶叶的活性物质改变，抑菌效果也不同。学者研究茶叶的抑菌活性时倾向于研究六大类茶叶，而较少研究茉莉花茶（再加工茶）的抑菌效果。在前者的基础上选取人们在日常生活中较喜欢饮用的青茶（半发酵茶）和红茶作为研究对象。其中，铁观音和茉莉花茶同属于青茶（半发酵茶的一种），其茶多酚水平较一致。不同的是在制作过程中将茉莉花用窨制的方法浓缩在茶叶中[6]；作为一种全发酵茶，红茶在加工过程中，没有抑制茶多酚氧化酶的活性，从而促使儿茶素类物质氧化成邻醌进而形成茶黄素等氧化聚合物[7]。

以苏云金芽孢杆菌和大肠埃希氏菌作为指示菌，采用 6 mm 滤纸片进行抑菌圈试验。苏云金芽孢杆菌和大肠埃希氏菌分别是革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌的代表，测试 3 种茶叶，铁观音、红茶、茉莉花茶对其的抑菌效果。同时，探究了不同的茶叶浓度、提取时间及提取温度对指示菌抑菌效果的影响水平，得到较好的提取方案，方便日常生活中茶叶的冲泡，获得更好的抑菌效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 茶叶

铁观音，广东茗上茗茶叶有限公司提供；红茶（滇红）、茉莉花茶，广西贵港天福茶叶有限公司提供。

1.1.2 供试菌种

苏云金芽孢杆菌、大肠埃希氏菌，均来自岭南师范学院生命科学与技术学院微生物实验室。

1.1.3 药品

营养肉汤，青岛高科园海博生物技术有限公司提供；琼脂，上海北诺生物科技有限公司提供。

1.2 仪器

FA2004B 型电子天平，上海天美天仪器有限公司产品；H22-X 型九阳电磁炉，九阳股份有限公司产品；GFL-23 型电热恒温鼓风干燥箱，天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司产品；HH.S21-8-S 型电热恒温水浴锅，上海新苗医疗器械制造有限公司产品；BCD-251WDGW 型海尔冰箱，青岛海尔有限公司产品；LDZM-80KCS 型立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械有限公司产品；THZ-100 型恒温培养摇床，上海一恒科学仪器有限公司产品；SW-CJ-IBu型超净工作台，苏州净化设备有限公司产品；SPL-250 型生化培养箱，天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司产品。

2 试验方法

2.1 菌种活化

在无菌条件下，将指示菌种接入斜面营养肉汤培养基上，置于 37 ℃生化培养箱中培养 12 h，然后放置在 0～4 ℃的冰箱中冷藏，备用。试验前从斜面上挑取菌种接种于营养肉汤培养皿中，置于 37 ℃生化培养箱培养 12 h，上述方案重复 3 次，菌种活化完毕。

2.2 菌悬液制备

在无菌条件下挑取 1 环指示菌置于 50 mL 的液体培养基中，在 37 ℃条件下以转速 160 r/min 摇床培养12 h，放入 4 ℃冰箱中保存备用。

2.3 指示菌浓度

参照文献方法并稍作修改[8]。将菌液进行浓度梯度稀释，涂布平板，于 37 ℃条件下倒置培养 24 h后观察菌落生长情况，根据培养后，菌落的生长情况及抑菌圈大小明显程度，选取合适浓度作为供试菌悬液浓度。

2.4 茶叶粗提液的制备

5.0 g 茶叶浸泡在 100 mL 煮沸的蒸馏水中，静置30 min，得到 5 mg/mL 茶叶浸出液[9]。用滤纸将茶叶的粗提取物过滤，得到均一、稳定的液体。

2.5 浸出液滤纸片的制备

将干净的滤纸用打孔器打成直径为 6.0 mm 边缘清晰的纸片，置于 121 ℃烘箱中干热灭菌 2 h，冷却备用[10]。将无菌滤纸片和粗提液在无菌操作台中浸泡30 min，滤出，风干备用。

2.6 抑菌试验

试验采用抑菌圈法，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基制成平板，分别均匀涂布 2 种菌悬液。每个培养皿放置 4 片滤纸，每组 3 个平行，以不加药液作为空白对照。于 37 ℃下倒置培养 24 h 后，分别测量并比较各样品的抑菌圈直径（mm）。

2.6.1 茶叶浓度对抑菌效果的影响

按照 2.4 所示的试验方法，在基本条件为 100 ℃，30 min，制取质量浓度分别为 1，2，3，4，5 mg/mL的茶叶提取液，用 2 种指示菌测试不同质量浓度下的抑菌效果。

2.6.2 提取时间对抑菌效果的影响

按照 2.4 方法所示，以 100 ℃，5 mg/mL 为基本条件，探究提取时间分别为 10，20，30，40，50 min下，提取时间对抑菌效果的影响。

2.6.3 提取温度对抑菌效果的影响

按照 2.4 的试验基础，以 5 mg/mL，30 min 为基本条件，提取温度分别取 60，70，80，90，100 ℃为提取温度。探究不同的提取温度下，茶叶粗提物对指示菌效果的影响，采用 2.6 中的试验方法进行试验。

3 结果与分析

3.1 茶叶种类对细菌的抑制效果的影响

3.1.1 3 种茶叶提取物对苏云金芽孢杆菌的抑制效果

3 种茶叶提取物对苏云金芽孢杆菌的抑制作用见图 1。

由图 1 可知，铁观音、茉莉花茶对苏云金芽孢杆菌的抑制效果大于红茶对苏云金芽孢杆菌的抑制效果，抑菌效果为铁观音 = 茉莉花茶 > 红茶，但 3种茶叶对苏云金的都处于中度敏感。抑制强度随着3种茶叶提取液质量浓度的加大效果加强。

图1 3 种茶叶提取物对苏云金芽孢杆菌的抑制作用

在杨建英等人[11]的报道中提出，茶叶中主要的抑菌物质为酚类物质，茶多酚的抑菌机理是酚羟基和疏水的苯环与蛋白质分子中的氨基或羧基结合，使细菌蛋白凝固、细菌细胞膜结构被破坏，细菌遗传物质 DNA 牢固结合，改变细菌的生理生化功能，从而达到抑制细菌生长的效果。铁观音和茉莉花茶同属于半发酵茶的一种（青茶），红茶属于全发酵茶，发酵过程中在酶的作用下，茶叶中多酚类物质发生氧化和降解，产生茶红素、茶黄素、茶褐素和多糖类物质，造成茶多酚减少，从而铁观音和茉莉花茶的抑菌效果大于滇红的抑菌效果。

3.1.2 3 种茶叶对大肠杆菌的抑制作用

3 种茶叶提取液对大肠杆菌的抑制效果见图 2。

图2 3 种茶叶提取液对大肠杆菌的抑制效果

由图 2 可知，在茶叶粗提取液质量浓度为 1～5 mg/mL 时、3 种茶叶对大肠杆菌（革兰氏阴性菌）的抑制效果均不强，呈现出低度敏感，与茶叶种类的相关性不大。在茶叶粗提物质量浓度为 1 mg/mL时，抑菌圈无明显边界。

采用大肠埃希氏菌和苏云金芽孢杆菌作为指示菌，其中大肠埃希氏菌为革兰氏阴性菌的代表，苏云金芽孢杆菌为革兰氏阳性菌的代表。茶叶粗提物抑菌圈直径的判定标准是: 抑菌圈直径 >15 mm 为高度敏感、10～15 mm 为中度敏感、7～9 mm 时为低度敏感，无抑菌圈则为不敏感。由折线图 1、2 的试验结果对比下可看出，铁观音，滇红和茉莉花茶对苏云金芽孢杆菌（革兰氏阳性细菌）抑菌圈直径较大，综合比较可得，抑菌效果为苏云金芽孢杆菌 > 大肠杆菌。

通过抑菌圈试验结果表明，茶叶粗提物对革兰氏阳性细菌的抑菌效果高于对革兰氏阴性细菌的抑菌效果。在茶叶粗提物质量浓度为 5 mg/mL 时，对苏云金芽孢杆菌的抑制作用达到中度敏感，而大肠杆菌的抑制作用处于低度敏感水平。在李辉[12]的报道指出，茶多酚对金黄葡萄球菌的抑制效果好于大肠杆菌的抑制效果，抑菌效果与茶多酚质量浓度呈正比。而在孙昊等人[13]的试验显示明茶多酚中的儿茶素对于草生欧文氏杆菌、枯草芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌和大肠杆菌均有较明显的抑菌效果，在茶叶粗体液质量浓度为 2 mg/mL 时出现抑菌圈，5 mg/mL 时抑菌圈最大。结合图 2 试验结果，可以验证当茶叶质量浓度为 2 mg/mL 时，大肠杆菌才出现抑菌圈。

质量浓度较低时，茶叶且 3 个平行组之间有无抑制作用的平板、增大了试验的误差。为了更好地进行试验，探究提取时间和提取温度对抑菌效果的影响和找出大肠杆菌抑制效果较好的质量浓度，故在此试验基础上，增大了茶叶粗提取液的质量浓度。

不同茶叶对大肠杆菌的抑菌效果见图 3。

图3 不同茶叶对大肠杆菌的抑菌效果

由图 2 和图 3 可知，在茶叶粗提物质量浓度为1～5 mg/mL 时，对大肠杆菌的抑制效果为茉莉花茶 >滇茶 > 铁观音。红茶在加工的过程中茶多酚转化酶活性没有被抑制，大约有 90%的茶多酚氧化成茶黄素。有研究人员表明在低质量浓度时，大肠杆菌对茶黄素的敏感程度强于金黄色葡萄球菌。茉莉花茶作为一种花茶（再加工茶），是 2 种抑菌物质（茶多酚和茉莉花）效果的叠加，韦英亮等人[14]的试验结果表明茉莉花渣黄酮对普通变形杆菌、大肠杆菌、葡萄球菌和枯草芽孢杆菌有一定的抗菌作用。

3.2 提取时间对抑菌圈直径的影响

3.2.1 对苏云金芽孢杆菌抑制效果的影响

按照 2.6.2 方法进行试验。控制茶叶浓度和提取温度不变，探究 3 种茶叶在不同温度下对苏云金芽孢杆菌的效果并绘制了折线图。

提取时间对茶叶抑制苏云金芽孢杆菌效果的影响见图 4。

由图 4 可知，在基础条件为 5 mg/mL，100 ℃时，铁观音和茉莉花茶在提取时间为 20 min 时，对苏云金芽孢杆菌有较强的抑制作用。茉莉花茶在提取时间为 20 min 时，属于高度敏感。在 20 min 之后，铁观音和茉莉花茶对苏云金芽孢杆菌的抑制作用都有一定下降。而红茶的最佳提取时间出现在 40 min左右，较 30 min 的抑菌效果有些许上升。综上可知，提取时间对不同茶叶抑制苏云金芽孢杆菌的效果影响依次为铁观音 > 茉莉花茶 >红茶。

图4 提取时间对茶叶抑制苏云金芽孢杆菌效果的影响

3.2.2 对大肠杆菌的抑制效果影响

按照试验 2.6.2 所示方法进行试验，探究 3 种茶叶在不同的提取时间下对大肠埃希氏菌的抑制效果。

提取时间对茶叶抑制大肠杆菌效果的影响见图 5。

图 5 提取时间对茶叶抑制大肠杆菌效果的影响

由试验结果可得，以 10 mg/mL，100 ℃为基本提取条件，铁观音、茉莉花茶和红茶随着提取时间的增加，对大肠杆菌的抑制效果也增强。铁观音由抑菌圈直径 9.9 mm 增加至 11.9 mm。而茉莉花茶则是由 12.4 mm 增加至 13.6 mm。而红茶的抑菌圈直径由 8.4 mm 增加至 11.4 mm。综上可知，提取时间对抑制大肠杆菌的影响水平铁观音 > 茉莉花茶 >红茶。

3.3 提取温度对抑菌效果的影响

3.3.1 提取温度对抑制苏云金芽孢杆菌的影响

按照 2.6.3 的试验方法进行试验，探究提取温度对茶叶提取液抑制苏云金芽孢杆菌的效果影响。

不同提取温度对茶叶粗提物抑制苏云金芽孢杆菌的影响见图 6。

由图 6 可知，在 5 mg/mL，100 ℃的基本条件下，茉莉花茶和红茶随着提取温度的上升，对苏云金芽孢杆菌的抑制圈增大，但铁观音的提取效果在80 ℃达到了 15.3 mm，处于高度敏感水平。提取温度对茶叶粗提物抑制苏云金芽孢杆菌的影响效果为红茶 > 铁观音 = 茉莉花茶。相关试验曾指出提取温度为 25～80 ℃时，茶多酚保持了很好的抑菌活性[15]；大于 80 ℃时，茶多酚的抑菌活性变化趋势最大，抑菌效果得到抑制[16]。而红茶的主要抑菌物质是茶黄素，茶黄素具有热稳定性。

3.3.2 提取温度对抑制大肠杆菌的影响

采用 2.6.3 所示的试验方法，探究不同提取温度下，茶叶粗提物对大肠杆菌的抑制效果的影响。

不同提取温度对茶叶粗提物抑制大肠杆菌的影响见图 7。

图 6 不同提取温度对茶叶粗提物抑制苏云金芽孢杆菌的影响

图 7 不同提取温度对茶叶粗提物抑制大肠杆菌的影响

由图 7 可知，提取温度增加，红茶和茉莉花茶的粗提物对大肠杆菌的抑制效果逐渐增加。不同的是铁观音在 90 ℃时提取效率达到最大值。提取温度随后下降。结合 3.3.1 和 3.3.2 的试验结果，可得出绿茶的提取条件较茉莉花茶和红茶温和。综合试验结果可得，提取温度对抑菌效果的影响为茉莉花茶 >绿茶 >红茶。

3.4 茶叶提取正交试验

3.4.1 正交试验设计

正交试验因素与水平设计见表 1。

表1 正交试验因素与水平设计

从以上单因素结果分析，提取温度、提取时间、茶叶粗提取液浓度因素之间存在着相互作用关系。在单因素试验中铁观音对提取时间及提取温度的敏感度较大，依据人们饮茶茶习惯，选取铁观音作为正交试验材料。以铁观音（绿茶）抗苏云金芽孢杆菌为例，将提取温度（A），提取时间（B），茶叶质量浓度（C） 3 个因素及其水平值作为试验条件，得到 L9（33）。

3.4.2 正交试验结果分析

正交试验结果见表 2。