高效液相色谱法同时检测液体食品中6种人工合成色素

2022-03-11童优芸王小宝王晓燕丁文慧

安徽农业科学 2022年4期

童优芸王小宝王晓燕丁文慧

摘要 [目的]通过优化高效液相色谱条件和前处理步骤，建立高效液相色谱法同时测定液体食品中柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝、诱惑红6种人工合成色素，以此提高合成色素的检测效率。[方法]试验优化了前处理方法，液体食品基质比较干净时采用直接水提进样法，基质比较复杂时采用固相萃取净化法;优化了梯度洗脱程序和波长程序等仪器条件。[结果]6种人工合成色素浓度在5～50 μg/mL 线性关系良好（R2>0.999）;柠檬黄、苋菜红、日落黄、胭脂红、诱惑红的检出限为0.031 25 mg/kg，亮蓝的检出限为0.125 00 mg/kg，样品添加标准物质后平均回收率在89.0%～100.3%，相对标准偏差（RSD）在1.56%～3.12%。[结论]该研究可为实验室日常的人工合成色素检测提供参考。

关键词高效液相色谱;食品;人工合成色素;仪器条件;前处理;方法优化

中图分类号 TS 207文献标识码 A文章编号 0517-6611（2022）04-0190-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.04.049

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Simultaneous Detection of Six Synthetic Pigments in Liquid Food by High Performance Liquid Chromatography

TONG You-yun1，WANG Xiao-bao2，WANG Xiao-yan1 et al

（1.Sion Inspection Service Co.， Ltd.， Ningbo， Zhejiang 315000;2.Ningbo Academy of Product and Food Quality Inspection （Ningbo Fibre Inspection Institute），Ningbo，Zhejiang 315000）

Abstract [Objective] By optimizing the conditions and pretreatment steps of high performance liquid chromatography， a high performance liquid chromatography method was established for the simultaneous determination of 6 synthetic pigments of lemon yellow， amaranth， carmine， sunset yellow， brilliant blue， and allure red in liquid food， so as to improve the detection efficiency of synthetic pigments.[Method] The experiment optimized the pretreatment method. The direct water extraction method was used when the liquid food matrix was relatively clean， and the solid phase extraction purification method was used when the matrix was more complicated;the instrument conditions such as gradient elution procedure and wavelength procedure were optimized.[Result] The concentration of 6 kinds of synthetic pigments has a good linear relationship between 5-50 μg/mL （R2>0.999）.The detection limit of lemon yellow， amaranth， sunset yellow， carmine and allure red was 0.031 25 mg/kg， and the detection limit of brilliant blue was 0.125 00 mg/kg. The average recovery rate of samples after adding standard substances was 89.0%-100.3%，the relative standard deviation （RSD） was 1.56%-3.12%.[Conclusion] This study can provide reference for the daily synthetic pigment detection in laboratories.

Key words High performance liquid chromatography （HPLC）;Food;Synthetic pigments;Instrument conditions;Pretreatment;Method optimization

作者简介童优芸（1987—），女，浙江宁波人，工程师，从事食品质量检测工作。

收稿日期 2021-06-22;修回日期 2021-07-15

食用人工合成色素是通过人为化学合成的一类有机物质，由于其本身艳丽的色彩，可作为食品加工过程中的着色剂，不仅使食品具有赏心悦目的色彩，更能增加商品的价值，吸引消费者的眼光。但是，人工合成色素其本身或者次生的产物对人体产生一定的毒性，另外一些不法商贩超标、超范围使用人工合成色素的现象屡禁不止，长期过多地摄入人工合成色素会使人们的健康受到威胁[1-3] 。所以，加强食品安全的监管，提高检测技术，开发一种快速、便捷、准确的检测方法势在必行。目前，检测人工合成色素的国家标准方法主要有GB/T 5009.35—2016《食品中合成着色劑的测定》、GB/T 5009.141—2016《食品中诱惑红的测定》、GB/T 9695.6—2008《肉制品胭脂红着色剂测定》、GB/T 21916—2008《水果罐头中合成着色剂的测定高效液相色谱法》、SNT 1743—2006《食品中的诱惑红、酸性红、亮蓝、日落黄的含量检测高效液相色谱法》，所用分析手段有高效液相色谱法[4-6]、电泳法[7-8]、分光光度法[9]等，主要以高效液相色谱法为主，以上方法对食品中人工合成色素测定应用或参考具有一定的价值，但同时存在一些问题，如部分标准适合单个合成色素或单种食品基质测定;采用聚酰胺吸附法过程烦琐、耗时;色谱条件不合理导致目标峰分离度差;纸层析色谱法回收率低、检出限高、精密度差等[10]。该试验拟在国家标准的基础上，开发一种更为简单有效的样品前处理方法，并建立一种能同时检测多种人工合成色素的检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试样品为市售液体食品。日落黄标准溶液、柠檬黄标准溶液、胭脂红标准溶液、苋菜红标准溶液、亮蓝标准溶液、诱惑红标准溶液，濃度均为0.500 mg/mL，中国计量科学研究院;甲醇，色谱纯，默克;甲酸，色谱纯，美国MREDA;乙醇、氨水、乙酸铵，优级纯，国药集团化学试剂有限公司;试验用水均为超纯水（一级）。聚酰胺小柱，1 g/6 mL，博纳艾杰尔有限公司;HLB萃取柱，6cc（200 mg），Waters公司;色谱柱，XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），美国安捷伦公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪，Agilent 1200，美国安捷伦公司;超声波，SK8200HP，KUDOS;纯水机，UPWS-1-10T，杭州永洁达净化科技有限公司;离心机，Fisher x1r，Thermo;固相萃取装置，ASE-12，天津奥特赛恩斯仪器有限公司;氮吹仪，N-EVAP112，OA-SYS;电子天平，BS 224S，Sartorius;紫外分光光度计，Lambda 25，PrekinElmer。

1.3 仪器工作条件

色谱柱为美国安捷伦XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;进样量20 μL;柱温30 ℃;流速1 mL/min;流动相为甲醇-乙酸铵0.02 mol/L[11];流动相pH 6～7。波长程序：0～9.5 min，检测波长254 nm;9.5～16.0 min，检测波长409 nm。流动相梯度洗脱程序见表1。

1.4 试验方法

1.4.1

基质干净的液体样品前处理法。称取20～40 g（精确至0.001 g）样品，调pH至6左右，定容至10 mL，用超声波振荡10 min，5 000 r/min离心10 min，过0.45 μm 水相滤膜，收集至样品瓶，上机。

1.4.2

基质复杂的液体样品前处理法。

1.4.2.1 提取。①饮料：称取20～40 g（精确至0.001 g）样品放入100 mL烧杯中，含二氧化碳样品加热去除二氧化碳，调pH至6左右备用。

②酒类：称取20～40 g（精确至0.001 g）样品放入100 mL烧杯中，加热去除乙醇，调pH至6左右备用[12]。

③酱汁类：称取20～40 g（精确至0.001 g）样品放入50 mL离心管中，加入20 mL 石油醚，漩涡混匀1 min，5 000 r/min离心5 min，弃去石油醚上清液，加入10 mL 1%氨水溶液，漩涡1 min，4 000 r/min 离心5 min，重复提取至提取液无色，合并上清液，调pH至6左右备用。

1.4.2.2

净化。先用6 mL甲醇、6 mL水（pH=6～7）活化聚酰胺小柱（1 g/6 mL），加入样液，用6 mL水（pH=4）、6 mL甲醇∶甲酸（6∶4）、6 mL水（pH=6～7）淋洗，通入空气吹干小柱，用6 mL 2%的氨化甲醇洗脱，洗脱液于50 ℃氮气吹干，用水定容至5 mL，过0.45 μm水相滤膜，收集至样品瓶，上机。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 检测波长的选择。用紫外分光光度计对柠檬黄、日落黄、亮蓝、胭脂红、苋菜红、诱惑红进行200～600 nm波长扫描，通过分析物质的特征波长，得到各物质的最大吸收波长分别为柠檬黄260 nm、日落黄230 nm、苋菜红230 nm、胭脂红220 nm、亮蓝410 nm、诱惑红220 nm。除亮蓝外的5种人工合成色素在250 nm下均有较好的紫外吸收，且出峰时间比亮蓝早，所以在0～9.5 min紫外吸收波长设置为254 nm，而亮蓝在410 nm下有较好的紫外吸收，其出峰时间在10 min左右，所以9.5 min后紫外吸收波长设置为409 nm。6种人工合成色素可在波长程序下有较好的响应值。

2.1.2

梯度洗脱程序的选择。GB/T 5009.35—2016《食品中合成着色剂的测定》中采用的洗脱条件，得到的色谱图中各个目标峰基本能分开，且峰形良好。但是柠檬黄和苋菜红这2个物质出峰时间比较接近，容易被杂质峰覆盖，进而影响定性和定量。该试验依据国标洗脱条件，并参考其他相关文献，对甲醇和乙酸铵2个流动相的比例进行调整，发现适当拓宽甲醇的比例范围能使各个目标峰具有更好的分离度，而且能使柠檬黄和苋菜红的出峰时间延长，有效地与杂质峰进行分离。优化条件后图谱和国标方法比较见图1。

2.1.3 色谱柱的选择。色谱柱是分离的核心，选择色谱柱的要求是柱效高、选择性好、分析速度快等。市售的用于HPLC的各种微粒填料如多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）、多孔碳等，其粒度一般为3、5、7、10 μm等。C18和C8色谱柱的应用较为广泛，都属于反相色谱柱。C8适合分析大分子类的物质，其对同一个物质的保留能力比C18柱弱，保留时间比C18柱早，一些物质出峰过于靠前时使用C8柱很难实现分离。C18柱对中等极性化合物保留最强，主要应用于羧基、脂肪酸、苯胺、甘油酯等物质的测定，对分子量较小的物质有较好的分离效果。因此，考虑合成色素的保留时间和分离度，选用C18柱作为此次试验的色谱分析柱。

2.1.4

流动相pH的选择。在其他条件固定的情况下（因为考虑到出峰时间的不一致，所以未采用波长程序），试验用柠檬酸和氨水调节乙酸铵的pH，分别比较了pH为4、6、8时的图谱情况。结果表明（图2），当pH为4和8时，均出现基线漂移、定量不准的现象;当pH为6时，色谱图出峰良好，且呈现较好的分离度。因此，选择流动相pH为6。

2.1.5

流速的选择。在其他条件固定的情况下（因为考虑到出峰时间的不一致，所以未采用波长程序），试验将流速依次设置为1.0、0.8、0.6 mL/min，得到的色谱图（图3）顯示，流速减少，各个色素峰出峰时间相应延后，分离度变差。且12～14 min容易被杂质峰影响，因此，综合考虑保留时间、分离度等因素，最终确定流速为1.0 mL/min。

2.1.6

柱温的选择。在其他条件固定的情况下，试验将柱温设定为20、30、40 ℃，得到的色谱如图4所示。结果表明柱压随着柱温的降低而升高，在柱温设置为20 ℃时，柱压最高达18 000 kPa，长期使用会对色谱柱的寿命产生一定的影响。温度升高，各个组分的保留时间相应缩短，分离度变小，所以，综合考虑保留时间、柱压、分离度等因素，最终确定柱温为30 ℃。

2.2 标准曲线、线性相关和检出限

准确吸取2 mL柠檬黄、苋菜红、胭脂红、亮蓝、日落黄标准溶液和1 mL诱惑红标准溶液于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配成100 μg/mL的混合标准储备液。再分别稀释为5、10、15、20、25、50 μg/mL。在最佳色谱条件下从低浓度到高浓度测定各个组分的峰面积，以峰面积（Y）对浓度（X）进行线性拟合，得到6种人工合成色素的线性方程、决定系数，由表2可见，6种人工合成色素浓度在5～50 μg/mL时线性关系良好（R2>0.999）;根据3倍信噪比（S/N）计算出各组分检出限，柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄和诱惑红的检出限为0.031 25 mg/kg，亮蓝的检出限为0.125 00 mg/kg。

2.3 样品前处理方法的优化

样品前处理步骤会影响到结果的回收率、精密度，图谱的分离效果以及目标物的定性和定量。该试验针对不同基质的液体食品，采用2种前处理方法，并对这2种方法进行优化，得到较为适宜的前处理条件。

（1）直接水提法的条件选择。适合基质较为干净的液体食品。该试验以添加有柠檬黄的市售水晶葡萄汁为例，水晶葡萄汁本身不含柠檬黄，添加量为100、200、400 μg，定容后浓度分别为10、20、40 μg/mL，检测浓度均在标准曲线范围内，每组添加量做3次平行试验。前处理过程中超声混匀时间、超声功率和离心时间均有可能影响试验结果，最后步骤中的过水系滤膜，其材料会不同程度吸附合成色素，影响图谱结果。所以，试验以超声时间、超声功率、离心时间、水相过滤膜材料类型为因素，在其他条件固定的情况下，以样品中添加柠檬黄标准品的回收率为观测结果，分析比较各个因素下的最优条件。

结果表明，随着超声提取时间的增加，回收率随之增大，超声时间10～25 min所得到的回收率相近，考虑前处理过程的效率性，选定超声时间为10 min;超声功率在30 kHz时，回收率趋于最佳，此后增加超声功率对回收率影响较小，因此选定超声功率为30 kHz;随着离心提取时间的增加，回收效果随之变好，在离心提取时间为10 min时，回收率最高，随后离心提取时间增加，回收率趋于平缓，因此选定离心提取时间为10 min。

水系过滤膜是利用微滤技术去除合成色素提取液中不溶性成分和相对分子质量大于几十万的杂质，如淀粉、纤维素、植物胶、大分子蛋白质等。滤膜材料主要有纤维素类、聚酰胺类、聚醚砜类、聚偏二氟乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯等。试验比较了尼龙-66、CA（纤维素）、PES（聚醚砜）、PVDF（聚偏二氟乙烯）、PTFE（聚四氟乙烯）这5种过滤膜对合成色素的吸附作用，结果表明，尼龙-66的吸附作用最强，PTFE的吸附作用最弱，因此选用PTFE过滤，这与路勇等[13]的报道一致。

（2）固相萃取法的条件选择。适合基质较为复杂的液体食品，通过吸附作用，能有效地分离目标物质和杂质。该试验分别以市售的芒果汁、杨梅酒、酱汁为样品，用市售的2种规格型号固相萃取小柱来进行净化，以回收率和图谱情况为判断依据，来分析得到固相萃取法比较适宜的条件。第1种萃取柱为聚酰胺萃取柱，其填料为聚酰胺粉末（100～200目，1 g/6 mL）;第2种为HLB萃取柱，其填料为亲脂性二乙烯苯和亲水性N-乙烯基吡咯烷酮单体按一定比例组成的大孔共聚物（6cc，200 mg），保留机理为反相。试验结果表明，2种固相萃取柱对净化基质都有明显的效果，芒果汁添加6种人工合成色素后使用聚酰胺和HLB萃取柱的回收率分别为89.2%～97.6%和91.0%～98.9%，杨梅酒的回收率分别为93.5%～95.8%和89.6%～96.9%，酱汁的回收率分别为90.7%～99.6%和92.5%～102.3%，均符合试验要求。在价格方面，聚酰胺萃取小柱具有明显的优势，因此综合考虑检测成本，选用聚酰胺萃取小柱来净化样液。

3 结论

该研究结合GB/T 5009.35—2016《食品中合成着色剂的测定》和GB/T 5009.141—2016《食品中诱惑红的测定》，建立高效液相色谱法同时测定液体食品中柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄、诱惑红、亮蓝这6种人工合成色素，并对样品前处理方法和高效液相的仪器条件进行优化。最终确定的仪器条件：色谱柱为美国安捷伦XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;进样量20 μL;柱温30 ℃;流速1 mL/min;流动相为甲醇-乙酸铵0.02 mol/L;流动相pH为6～7。梯度洗脱程序：0～4.65 min，甲醇10%～30%;4.65～8.00 min，甲醇30%～80%;8～12 min，甲醇80%～10%;12～16 min，甲醇10%。波长程序：0～9.5 min，检测波长254 nm;9.5～16.0 min，检测波长409 nm。样品前处理方法：①基质简单样品采用直接水提进样法测定;②基质复杂样品采用聚酰胺固相萃取小柱净化法测定。结果表明，6种人工合成色素浓度在5～50 μg/mL线性关系良好（R2>0.999），柠檬黄、苋菜红、日落黄、胭脂红、诱惑红的检出限为0.031 25 mg/kg，亮蓝的检出限为0.125 00 mg/kg，检出限均低于国家标准。

优化的方法与国家标准方法比较，从以下几个方面来分析：①优化后降低了方法检出限，GB/T 5009.35—2016《食品中合成着色剂的测定》中柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄均为0.5 mg/kg，亮蓝为0.2 mg/kg[14];GB/T 5009.141—2016《食品中诱惑红的测定》中诱惑红检出限为25 mg/kg[15];SNT 1743—2006《食品中的诱惑红、酸性红、亮蓝、日落黄的含量检测高效液相色谱法》中日落黄、诱惑红测定低限为2.5 mg/kg，亮蓝为5.0 mg/kg[16]。优化方法后，柠檬黄、苋菜红、日落黄、胭脂红、诱惑红的检出限为0.031 25 mg/kg，亮蓝的检出限为0.125 00 mg/kg，均低于国家标准水平，说明优化后色谱条件和前处理方法提高了方法的灵敏度。②优化方法后所得到的检测数据准确可靠，所得到的图谱基线噪声低，分离度好，出峰时间和杂质峰分离，定性和定量更加准确。6种人工合成色素线性关系、决定系数以及样品加标平均回收率、相对标准偏差均满足试验要求。③优化后提高了试验效率，国标的前处理方法耗时、耗力、耗试剂，一般处理一个样品需花费30 min;优化后的前处理过程省时快捷，且试剂使用量少，不仅提高工作效率，还减少了对身体健康的危害。④优化后的方法能同时测定6种人工合成色素，相比较国标方法，更适合检测机构样品量大、项目繁杂的情况。

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