刘二龙 郑冠津 王毅谦 李志勇 魏霜 关丽军 卢丽 蒋湘 刘金华 王振华

摘要 [目的]为完善我国转基因检测方法体系，建立转基因大豆MON87751品系特异性实时荧光聚合酶链式反应（real time polymerase chain reaction，PCR）检测方法。[方法]根据MON87751的3′端邻接区序列设计特异性引物和探针，建立MON87751品系特异性实时荧光PCR检测方法，并测定该方法的灵敏度、特異性及可重复性。[结果]灵敏度测试显示，其定量下限为40拷贝;重复性试验显示其相对标准偏差在可接受范围内。[结论]该研究建立的MON87751品系特异性实时荧光PCR检测方法特异性良好，灵敏度高，有良好的可重复性，适合对转基因大豆MON87751品系进行检测鉴定。

关键词 实时荧光PCR;转基因大豆MON87751;品系特异性

中图分类号 S 565.1文献标识码 A

文章编号 0517-6611（2022）04-0102-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.04.027

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Establishing an Event-specific Real-time Polymerase Chain Reaction Detection Method for Genetically Modified Soybean Event MON87751

LIU Er-long1，ZHENG Guan-jin1，WANG Yi-qian2 et al （1.Huangpu Customs Technology Center，Guangzhou，Guangdong 510730;2.Animal Plant and Food Inspection Center of Nanjing Customs，Nanjing，Jiangsu 210019）

Abstract [Objective]In order to improve the genetically modified detection method system in China，a real-time polymerase chain reaction （PCR） detection method specific to the genetically modified soybean MON87751 was established.[Method]The specific primer pairs and probe based on the sequence of the 3' adjacent region of MON87751 were designed and then the real-time PCR detection method was established.The specificity，sensitivity and repeatability were analyzed.[Result]The real-time PCR method was specific for detecting MON87751.The limit of quantification （LOQ） was 40 copies MON87751 genomic DNA.Repeatability of the established event-specific real-time PCR method was assessed and the relative standard deviation （RSD） was within the acceptable range.[Conclusion]The established event-specific quantitative real-time PCR method of MON87751 has good specificity，high sensitivity and good reproducibility，and is suitable for the identification of soybean MON87751.

Key words Quantitative real-time PCR;Genetically modified soybean MON87751;Event-specificity

基金项目 广东省科技计划项目（2017B020207008）;广州市科技计划项目（201704030125）;国家重点研发计划（2018YFF0215605）;南京海关科技计划项目（2021KJ18）。

作者简介 刘二龙（1978—），男，湖南郴州人，高级兽医师，硕士，从事动植物分子鉴定研究。*通信作者，博士，从事食品安全快速检测技术研究。

收稿日期 2021-04-06;修回日期 2021-05-24

大豆是一种富含蛋白与脂肪的粮食及油料作物。我国是世界大豆第一消费国和进口国，国产大豆难以满足国内市场消费需求，故而大豆贸易逆差大，2019年大豆进口量为8 851万t[1]。

转基因大豆MON87751由孟山都公司研发，其含有稳定整合的cry1A.105和cry2Ab2表达盒[2]，主要产生Cry1A.105和Cry2Ab2两种针对鳞翅目害虫的杀虫蛋白。MON87751于2014年在美国上市，目前在欧盟、澳大利亚、新西兰、加拿大、日本、韩国、中国台湾和美国等国家或地区获得批准允许用作食品、饲料或种植。为完善我国转基因产品检测技术体系，为转基因产品的监管提供强有力的技术支持，笔者采用实时荧光PCR技术平台，根据MON87751 3′端邻接区序列设计引物、探针，建立了MON87751品系特异性检测方法，以期为实现高通量的检测提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

转基因油菜MON88302、转基因棉花MON88913、转基因油菜DP-073496-4、转基因大豆A2704-12、转基因大豆GTS 40-30-2、转基因甜菜H7-1、转基因玉米MON810、转基因玉米NK603、转基因玉米BT11、转基因玉米MIR162、非转基因大豆為黄埔海关技术中心购置及保存;大豆内源基因植物凝集素基因（Lectin基因）和MON87751品系特异性外源基因双基因阳性质粒为黄埔海关技术中心构建。

主要试剂：Primex Ex Taq（2×） for qPCR（TAKARA）;引物和探针工作液的终浓度为10 μmol/L（上海闪晶生物）;DNA提取试剂盒DP-305（北京天根）。

主要设备：实时荧光PCR仪ABI7500fast、ABI7500（美国应用生物系统公司）;研磨机Tube Mill 100 control（德国IKA）;微量分光光度计 nanodrop2000c（美国Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取。称取100 mg研磨成粉末状的样品提取样品中的基因组DNA，测定DNA浓度并于4℃保存备用。

1.2.2 引物组和探针设计。根据转基因大豆MON87751品系3′端邻接区序列（品系特异性片段），应用Primer Primer 5.0 软件设计引物和探针。选用内源基因Lectin用于样本核酸提取质量监测及定量分析。

1.2.3 实时荧光PCR反应体系退火温度及引物探针配比的优化。采用TAKARA RR390酶系对不同体积的引物探针进行优化（25 μL体系）。A组：Premix Ex TaqTM 12.5 μL，ROX Reference Dye II 0.2 μL，10 μmol/L MON87751-F和MON87751-R各0.5 μL，10 μmol/L探针MON87751-P 1.0 μL，模板2.0 μL和ddH2O 8.3 μL。 B组：Premix Ex TaqTM 12.5 μL，ROX Reference Dye II 0.2 μL，10 μmol/L MON87751-F和MON87751-R各0.4 μL，10 μmol/L探针MON87751-P 0.8 μL，模板2.0 μL和ddH2O 8.7 μL。C组：Premix Ex TaqTM 12.5 μL，ROX Reference Dye II 0.2 μL，10 μmol/L MON87751-F和MON87751-R各0.2 μL，10 μmol/L探针MON87751-P 0.4 μL，模板2.0 μL和ddH2O 9.5 μL。

退火延伸温度分别设置为60和58 ℃，反应程序为95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s、60 ℃（58 ℃） 34 s，40个循环，于60 ℃（58 ℃）收集荧光信号。

1.2.4 特异性测试。用“1.2.1”的方法提取“1.1”中样品DNA为模板，阳性对照为Lectin-MON87751质粒，阴性对照为非转基因大米DNA，进行特异性测试。

1.2.5 灵敏度测试。

将提取的Lectin-MON87751DNATE缓冲液稀释至4 000000、400000、40000、4000、400、40和20拷贝/μL进行转基因大豆MON87751实时荧光PCR检测，进行灵敏度测试。

1.2.6 可重复性测试及建立标准曲线。

将提取的Lectin-MON87751质粒DNA溶液加入TE缓冲液稀释至4 000 000、400 000、40 000、4 000、400、40和20拷贝/μL，每个样品进行3次重复试验，进行实时荧光PCR检测线性范围测试及可重复性测试。

2 结果与分析

2.1 方法的建立及优化

2.1.1 实时荧光PCR引物和探针设计。

通过分析转基因大豆MON87751 3′端邻接区序列设计的多组引物和探针，分析引物与探针的反应效率、扩增效果，最终选择表1中的引物和探针建立MON87751品系特异性检测方法。

2.1.2 PCR反应体系优化。

在扩增体系的退火温度为58 ℃时，3组引物探针组B、A和C的扩增曲线均扩增良好，其中Ct值最小为B组（图1）;温度为60 ℃时，B、A和C 3组均扩增良好，A和B组Ct值接近，C组Ct稍高，但3组引物探针Ct值较退火温度为58 ℃时Ct值高（图2）。因此，基于扩增效率和经济性，考虑选择B组体积配比、58 ℃作为退火温度引物探针配比。

2.2 特异性测试 由图3可知，采用MON87751品系特异性MON87751-F/R/P引物和探针进行实时荧光PCR时，其他农作物材料DNA为模板的反应均无典型荧光扩增曲线，只有阳性样品MON87751的DNA模板有典型荧光扩增曲线，表明该研究的检测方法特异性良好。

2.3 灵敏度测试、可重复性测试及标准曲线建立

按“1.2.5”进行7个浓度梯度扩增，其最低检测浓度为20拷贝/μL。扩增曲线见图4。

2.4 标准曲线制备 按“1.2.6”进行转基因大豆MON87751品系实时荧光PCR检测，测试结果的Ct值见表2。根据表2中Ct值数据与拷贝数对数值建立线性回归方程为y=-3.43x+42.12，扩增效率95.55%（90%～110%），R2为0.99，表明该方法的线性相关性良好，扩增效率满足定量检测标准的要求（图5），且在线性范围内，Ct值的SD为0.04～0.39，RSD为0.20%～1.27%（表2）。最低模板量40拷贝时，其RSD远小于25%，设定该方法的定量限为40拷贝。

3 讨论

目前对转基因产品多数国家均采用相应的标识管理制度，转基因产品标识需要检测方法的支撑。欧盟转基因食品和饲料基准实验室有建立MON87751 5′边界序列的PCR检测方法[4]，但国内尚缺乏该检测方法及相关标准。实时荧光定量PCR技术在转基因检测中应用广泛，被誉为“金标准”，其可监测PCR进程中探针发光基团的信号，从而实现定性或定量分析[5-7] 。

品系特异性PCR（Event-specific PCR）检测方法检测的目标序列是外源基因与植物基因组间边界序列，甚至可以区分相同质粒转化的转基因品系[8]，品系特异性检测方法报道较早见于Bt11品系检测方法的建立[9]，目前在转基因品系鉴定中应用广泛[10-15]。

该研究针对转基因大豆MON87751 3′端边界特异性序列，基于实时荧光PCR平台，设计引物和探针建立MON87751品系特异性检测方法，定量下限为40拷贝，扩增效率为95.55%，重复性测试显示，各平行间样品所得Ct的RSD均远小于25%，表明该方法特异性良好，灵敏度较高，具有良好的稳定性，可为相关部门鉴定检测转基因大豆MON87751提供方便快捷的方法。

参考文献

[1]

王红蕾.浅谈中国2020年度大豆行业市场状况与区域竞争格局[J].山西农经，2021（4）：104-105.

[2]ISAAA GM Approval DatabaseGM Crop Events ListMON87751 [EB/OL].（2013-01-12） [2020-03-31].https：//www.isaaa.org/ gmapprovaldatabase/event/default.asp？EventID=370.

[3] SAVINI C，MARETTI M，MAZZARA M，et al.Event-specific method for the quantification of soybean MON 87705 using real-time PCR validation report[R].2012.

[4] European Union Reference Laboratory for GM Food and Feed（EURL GMFF），Joint Research Centre（JRC），European Commission.Event-specific Method for the Quantification of Soybean MON 87751 Using Real-time PCR-Validation Report and Validated Method[R].2016.

[5]MARMIROLI N，MAESTRI E，GULL M，et al.Methods for detection of GMOs in food and feed[J].Anal Bioanal Chem，2008，392（3）：369-384.

[6]COTTENET G，BLANCPAIN C，SONNARD V，et al.Development and validation of a multiplex real-time PCR method to simultaneously detect 47 targets for the identification of genetically modified organisms[J].Anal Bioanal Chem，2013，405（21）：6831-6844.

[7]ANKLAM E，GADANI F，HEINZE P，et al.Analytical methods for detection and determination of genetically modified organisms in agricultural crops and plant-derived food products[J].Eur Food Res Technol，2002，214（1）：3-26.

[8] WU G，WU Y H，XIAO L，et al.Event-specific qualitative and quantitative PCR detection of genetically modified rapeseed Topas 19/2[J].Food Chem，2009，112（1）：232-238.

[9]ZIMMERMANN A，LTHY J，PAULI U.Event specific transgene detection in Bt11 corn by quantitative PCR at the integration site[J].LWT Food Sci Technol，2000，33（3）：210-216.

[10] 雷水娟，劉二龙，卢丽，等.转基因棉花MON88701品系特异性实时荧光PCR检测方法的建立[J].生物安全学报，2019，28（3）：225-229.

[11] 袁俊杰，魏霜，龙阳，等.转基因大豆MON87701和MON87708双重实时荧光PCR检测技术的建立与应用[J].农业生物技术学报，2020，28（2）：342-348.

[12] 鲁军，李刚，赵建宁，等.5种转基因油菜转化体特异性多重PCR检测方法[J].生物安全学报，2017，26（3）：244-250.

[13] 刘二龙，卢丽，吕英姿，等.转基因苜蓿草J163品系特异性实时荧光PCR检测方法的建立[J].食品安全质量检测学报，2015，6（1）：272-278.

[14] 刘二龙，卢丽，吕英姿，等.转基因甜菜GTSB77品系特异性实时荧光聚合酶链式反应检测方法建立[J].中国食品卫生杂志，2020，32（1）：49-52.

[15] 汪秀秀，杨捷琳，宋青，等.转基因棉花GHB119品系特异性定量PCR检测方法的建立[J].农业生物技术学报，2014，22（3）：380-388.

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