王 新，柳文睿，侯佳文，葛 玲，张亚楠

（沈阳工业大学 环境与化学工程学院，辽宁 沈阳 110870）

农药是农作物增产技术的首选，但它对人的健康和环境都有不利影响。农药分布广泛，可在空气、水和土壤中检测到其残留［1-2］。由于其在土壤中残留时间较长，因而在两年内仍会对一些耐性差的后茬轮种作物的产量产生影响［3］。目前，生物修复法对于低浓度农药残留污染土壤的修复具有一定的优势。该方法具有经济性、环保性以及不易破坏生态系统等优点。还有一些除草剂在非碱性条件下不易水解，只能通过微生物进行降解［4-6］。

近年来，已有研究者从环境中富集分离出以农药作为碳源的菌种。由于这些降解菌易受自然环境因素的影响［7］，在实际应用中的修复效果并不理想，而将其制备成微生物菌剂则会拥有更高的活性和耐受性［8］。

本文介绍了微生物菌剂的概念、类型、制备方法及降解污染物的效果，综述了相关的高效降解菌和生物强化菌剂的研究进展，介绍了国内外有关微生物菌剂治理土壤农药污染的应用实例。

1 微生物菌剂的概念、类型及有效微生物

微生物菌剂可由一种细菌、真菌及放线菌的单菌株或多种菌株复合而成［9-10］，是将上述菌株进行扩大繁殖后加工成的活菌制剂。它在恢复土壤肥力、维系根际微生物平衡、降解有机物等方面具有显著的效果［11］。

微生物菌剂按剂型可分为固体菌剂和液体菌剂，其中固体菌剂又分为颗粒剂和粉剂；按菌种种类可分为单一菌剂和复合菌剂；按有效菌类别可分为细菌菌剂、真菌菌剂和放线菌菌剂［12］。

表1列举了一些微生物对农药的降解效果。由表1可知，大部分的降解菌为细菌，其中，假单胞菌（Pseudomonassp.）和芽孢杆菌（Bacillussp.）的降解谱较为广泛，具有良好的应用前景。对比农药在液体培养基中的降解率与在土壤中的降解率可知，微生物菌剂在应用过程中受到环境的影响，修复效果衰减。

表1 有效微生物对农药的降解效果

2 微生物菌剂的制备

2.1 液体菌剂的制备

液体菌剂的制备通常分为两步：高效降解菌的获取和菌体的发酵培养。高效降解菌的获取主要有3种方法：1）从受污染的环境中富集分离、筛选；2）通过驯化获得降解菌种；3）将现有菌株通过基因改良技术提高其降解性能［43］。在获取高效降解菌后，通常通过发酵工艺进行培养。发酵工艺包括：固体发酵、液体深层发酵、固液两相发酵和分段培养工艺［43］。储存是液体菌剂大规模应用的难题，一般需要在高效降解菌的发酵液或发酵离心后的重悬液中加入防腐剂和保护剂。徐铭阳等［44］比较了苯甲酸钠、丙酸钙和山梨酸钾3种具有抑菌防霉作用的防腐剂对杂菌的抑制效果，发现苯甲酸钠效果最好。研究人员还对有机物助剂、稳定剂、无机盐助剂3类保护剂进行了正交筛选与复配，加入复配保护剂保存45 d后的液体菌剂10 d内对农田土壤残留啶虫脒的降解率仍达92.75%［44］。

2.2 固体菌剂的制备

固体菌剂的制备包括高效降解菌的获取、菌体混合培养、微生物固定化、干燥储存等4个步骤［45］。微生物固定化通常采用吸附法、包埋法和交联法等。菌剂载体是微生物生存的微环境，通过改变其传质特性可以提高微生物的存活率并保持活性。植物残体及其转化物用作菌剂载体可实现资源化利用。田秀梅等［46］以乙酸改性后的苎麻纤维为菌剂载体，菌剂活性较游离菌提高了30%。

固体菌剂的干燥方法有：鼓风干燥、喷雾干燥、冷冻干燥、微波真空干燥等。菌剂干燥通常需要添加干燥保护剂，常用的干燥保护剂有甘油、氨基酸、海藻糖、单糖、乳糖、多糖、聚乙烯二醇等［47］。将发酵、固定化、加入保护剂干燥粉碎、过筛制备的固体粉状菌剂在低温、密封无氧的条件下储存，有利于延长菌剂的有效期［45］。ARCHACKA等［48］将益生菌制成菌剂，比较后发现喷雾干燥法比冷冻干燥法成本更低且更方便；同时发现，海藻糖作为低温储藏保护剂对益生菌的保护效果最好，脱脂牛奶作为保护剂的喷雾干燥法制备的益生菌菌剂对恶劣环境抵抗力最佳。研究者比较发现，喷雾干燥法与鼓风干燥法所得活菌数相差不大，故选择易于操作、成本低廉、适合工业化生产的鼓风干燥法制备菌剂［49］。

3 微生物菌剂在农药污染土壤修复中的应用

目前，国内外对于微生物菌剂修复农药污染土壤大都处于实验室研究阶段。CUI等［50］从稻田土壤中分离出一株芽孢杆菌FE-1，将其制成液体菌剂降解土壤中的氟磺胺草醚。对于土壤中含量分别为1.0，3.0，5.0 mg/kg的氟磺胺草醚降解率分别为90.0%、90.1%和89.4%。此外，他们通过对玉米的鲜重和株高的测定发现，可有效减少对后茬作物生长的负面影响，土壤中FE-1的存在对敏感作物玉米没有有害影响。

然而土壤的理化性质影响着菌剂的应用。GUL等［51］分别采用黑曲霉和产黄青霉修复苯磺隆污染土壤，21 d后pH最低（6.6）的土壤样品中黑曲霉降解率最高（达95%）；而pH为8.6的土壤中黑曲霉降解率最低（为57%）；产黄青霉具有相同的趋势。可见在酸性土壤中污染物降解速率更大。FUENTES等［52］研究发现，菌剂在不同质地土壤中修复效果的大小顺序为粘土粉质壤土＞壤土＞砂土。

由于直接喷洒细菌悬浮液的降解效果很容易受到土壤性质的影响，LIU等［53］以蚕业废弃物蚕沙作为固定球形节杆菌菌株的载体，将在氯化钠中悬浮的菌液（1013CFU/mL）喷洒在蚕沙中，获得固体菌剂。通过表征发现，蚕沙能固定不同阶段的细菌，且在没有任何营养供应的情况下，一个月后大部分固定化细胞仍然存活。而后在广东省生物工程研究所实验农场甘蔗田中进行实验，发现使用固体菌剂后敌草隆平均半衰期从72.32 d缩短至7.69 d。将该固体菌剂用于不同类型土壤中（土壤含水率10%~50%）均具有良好的适用性，敌草隆降解率约为85%，且在中性、碱性条件下修复效果更好。徐铭阳等［54］以蚯蚓粪肥作为载体，制得的菌剂对土壤中含量为5 mg/kg的多菌灵的降解率为100.4%，且在保存30 d后对敌草隆的降解率仍能达到94.3%。

生物炭的高比表面积、高孔隙率及改善土壤理化性质的能力使其广泛应用于固体菌剂的制备［55-59］。ABDUL等［57］研究了生物炭固定复合菌群MB3R对马铃薯植被土壤中草克净的降解效果，在单独添加MB3R和MB3R固体菌剂的土壤中，草克净降解率分别为82%和96%。TAO等［59］通过将Fe3+化学共沉淀到玉米秸秆生物炭上，制备了一种铁改性生物炭（FeMBC）。由于FeMBC促进细菌胞外聚合物表面—NH官能团的形成，且通过与阿特拉津的芳香环相互作用，有利于微生物的捕获。利用其制备的固体菌剂加速了阿特拉津的降解速率，同时使稀有细菌丰度增加，稳定养分循环，有助于维持阿特拉津污染土壤中的细菌多样性。

也有学者使用包埋法制备固体菌剂。LIU等［60］利用聚乙烯醇和氯化钙固定无色杆菌JW-1，制备了固定化小球PSLB，其对土壤中含量为100 mg/kg的扑草净的降解率可达70.4%，显著高于未生物强化的处理效果。

关于土壤中长残留农药污染物的修复研究大都处于实验室阶段，但近年来越来越多的研究进入中试试验或现场实施。陈锐等［61］在西安植物园实验棚室内土壤中施用多菌灵并添加降解菌剂，发现多菌灵降解菌可在土壤中稳定定殖并迅速降低土壤中多菌灵的含量，修复10 d后多菌灵含量下降78%，可改善污染土壤中真菌微生物的多样性，对土壤理化性质及番茄作物生长无不良影响。曹博［24］选择玉米作为表征植物研究阿特拉津的原位土壤修复，利用草炭土等作为载体制备菌剂。结果表明：菌剂的加入不仅增加了农田原位土壤中除草剂污染物的消减速度，还可增产玉米。

4 存在的问题与展望

微生物菌剂中的微生物是决定生物强化效果的关键。目前的研究大多针对细菌，对于真菌和放线菌的研究较少。且目前的微生物菌种生理生化特性和降解机理研究大部分是针对单一污染物的研究结果，实际情况往往是多种污染物共存的复杂环境。而多菌种混合有助于在实际应用时得到更稳定的治理效果。传统载体不利于微生物与污染物之间的传质，现今各种复合载体的使用及纳米材料等新型载体的出现，显著提高了菌剂的作用效果。总之，微生物菌剂或肥料制剂的应用是一种消除土壤农药污染的有效方法。

虽然盆栽试验效果较好，但现场实验时发现农残降解率有所衰减，且菌剂的有效期仍有提升空间。这些方面的改善将有助于推进菌剂商品化。

综合以上分析，从微生物代谢网络的角度全面认识和掌握微生物菌种的生理生化特性和降解机理，进一步优化制备工艺和使用条件，并结合对环境中目标污染物及其他污染物特性的了解，研发出针对多种目标污染物、高耐受、长保质期的微生物菌剂，将是未来发展的主要方向。