王国骄

乳业生物技术国家重点实验室，上海乳业生物工程技术研究中心，光明乳业股份有限公司乳业研究院，上海 200436

0 引言

布丁为一种源自英国的传统食品，外形呈凝胶型半固体，深得中国消费者喜爱。近年来，含有丰富乳蛋白的牛奶布丁逐渐流行起来[1]。牛奶布丁是布丁家族中的一类由浆状材料凝固而制得的果冻状的凝胶型乳制品，一般作为饭后甜点或零食。随着我国国民经济水平的不断提升，消费者对于产品品质的追求日渐凸显，在食品方面，兼具口感和保健功能的产品成为市场新宠。目前市售布丁新品多表现在口味方面的变化[2]，而在营养与健康方面未见明显突破，且传统布丁在加工过程中，需要加入大量的增稠剂，来构建其稳定体系，这也不符合“大健康”的国策[3]。

肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）是一类重要的乳酸菌，能发酵糖类产生乳酸，具有高产酸、抗氧化和拮抗致病菌等能力；同时，因其能发酵产生乳酸及双乙酰类物质[4，5]，而被认为对多种传统食品的风味有重要贡献。目前肠膜明串珠菌肠膜亚种（Leuconostoc mesenteroidessubsp mesenteroides）已被广泛应用作食品领域的风味剂，如在奶酪成熟过程中，可以发挥特殊的风味作用[6]。

我国卫生部（卫生部公告2012年第8号）和美国食品药品监督管理局（FDA，1989）都将肠膜明串珠菌肠膜亚种列为安全可食用菌种。肠膜明串珠菌BD3749（CGMCC10064）是本试验室在前期工作中从传统食品——发酵后的泡菜中分离出的一株菌，可以高产胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）。经初步的研究表明，该菌株可特异性地合成不溶性EPS，并介导形成菌体及其他胞外物组成的复合结构[7，8]。BD3749合成的EPS的结构已被初步解析，其主要为高分子量的葡聚糖，虽不被人体消化吸收，但能特异性地促进某些有益菌的增殖[8]，因而可以作为新型的益生菌型膳食补充剂，有望对诸如糖尿病之类的慢性代谢性疾病起到干预作用。

番茄汁因其成本低、天然安全、来源广，且富含膳食纤维、多种维生素以及番茄红素等抗氧化成分，近年来被作为一种低成本的培养基，在科研及食品工业领域逐渐得到重视。随着对其研究的进一步深入，以番茄汁为基础介质的食品形式不断得到丰富[9]。这些食品具有安全性高、成本低、品质易于标准化以及可进行批量工业化生产等优点。此前的一些研究表明，明串珠菌菌株在番茄汁培养基中生长良好，且当蔗糖供给充足时，能够产生大量胞外多糖[10]。

据此，本文利用肠膜明串珠菌BD3749产生大量胞外多糖的这一特征，研制了一款基于番茄汁介质的奶布丁乳制品。该乳制品蛋白质含量高，且含有大量经发酵产生的高分子量葡聚糖，可以作为葡聚糖型膳食补充剂，且此产品无需添加增稠剂、稳定剂等食品添加剂，营养又健康，很好地契合了当下消费者对于食品的高品质需求。此外，该款产品利用了肠膜明串珠菌发酵产生的葡聚糖在质构及保水性方面的特点，可以实现产品外观形式上的花样化，在美味、营养和健康的基础上，增加了趣味性。

1 材料与仪器设备

1.1 试验材料

MRS固体培养基、MRS液体培养基，美国默克集团；脱脂乳粉，恒天然贸易有限公司；市场购得新鲜成熟番茄；-80℃冻存的肠膜明串珠菌BD3749（保藏编号为CGMCC10064），本实验室分离。

MRS培养基（1 L）含有蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，酵母膏粉10 g，葡萄糖20 g，吐温-80 1 g，K2HPO42 g，乙酸钠 5 g，柠檬酸三铵2 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，MnSO4·4H2O 0.05 g。

1.2 仪器与设备

超净工作台（UM/SK5），苏州智净净化设备有限公司；摇床（TS-20H），上海天呈试验仪器制造有限公司；涡旋振荡器（VORTEX-5），贝克曼库尔特国际贸易（上海）有限公司；pH计（FiveEasy），梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；全自动生长曲线分析仪（Bioscreen C），Oy Growth Curves Ab Ltd.。

1.3 试验方法

1.3.1 肠膜明串珠菌BD3749的冻干粉的制备

挑取2 个菌落，接种于300 mL的10%（w/w）的脱脂乳溶液里，于30 ℃培养4 h，在-80 ℃下预冻过夜后，于-20 ℃下冷冻干燥。

1.3.2 发酵种子液的制备

将肠膜明串珠菌BD3749的冻干粉用少量无菌蒸馏水溶解，用接种环取一环划线于含5%蔗糖的MRS固体培养基，30 ℃培养48 h取出，用接种环挑取单菌落放入10 mL含5%蔗糖的MRS液体培养基，运用涡旋振荡器将菌落均匀分散于液体培养基内，30 ℃，180 r/min振荡培养24 h后取出，以2%（v/v）接种量接种于含5%蔗糖的MRS液体培养基，30 ℃，180 r/min振荡培养24 h后，将培养物15 000 r/min离心10 min，弃去上清，菌体用无菌蒸馏水洗涤3 次后，用原培养体积的无菌蒸馏水悬浮，得到发酵用的种子液即为肠膜明串珠菌种子液，发酵种子液中肠膜明串珠菌菌落数为1 亿CFU/mL。

1.3.3 培养基的制备

（1）脱脂乳培养基（Medium A）制备

使用恒天然脱脂乳粉配制，比例为：5%脱脂乳粉+5%蔗糖，于105 ℃灭菌10 min后冷却至室温备用。

（2）番茄汁培养基（Medium B）制备

由市场购得新鲜成熟番茄，洗净，去皮，榨汁机压榨，80 目纱布过滤取汁，煮沸5 min，8 500 rmp离心10 min取上清，加入5%蔗糖，加热溶解后冷却，105 ℃灭菌10 min后冷却至室温备用。

（3）脱脂乳+番茄培养基（Medium A+B）制备

脱脂乳-番茄汁培养基（Medium A+B）由（1）和（2）中所述培养基按1:1比例混合而成，如表1所示，105 ℃灭菌10 min后冷却备用。

表1 不同组别的肠膜明串珠菌培养基的组成

1.3.4 肠膜明串珠菌BD3749在番茄汁及脱脂乳系统中的发酵

取1.3.2中制备的种子液按1:50的比例分别转接入A、B和A+B介质中，在30 ℃，180 rpm条件下培养。设定时间点为0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h，分别取样，进行活菌数及多糖产量的测定。

1.3.5 活菌数的检测方法

按设定的时间点取样，经梯度稀释后均匀涂布于MRS平板（每个样品做3 个重复），置于厌氧箱中培养48 h后进行菌落计数。通过所得的活菌数量绘制生长曲线。发酵过程中的pH使用pH计进行测定[11]。

1.3.6 多糖的产量测定

按下述方法分别对不溶性多糖和水溶性多糖的量进行测定，用两者产量总和作图。

（1）不溶性多糖的测定

发酵液冻干后，将冻干粉末与2 M的NaOH溶液以1 g∶4 mL的比例混合，室温浸提2 h，15 000 rpm离心10 min，取上清，用2.5 M的HCl溶液调节pH至7.0，15 000 rpm离心10 min后取沉淀，冷冻干燥后称重即得水不溶性胞外多糖的量[12]。

（2）可溶性多糖的测定

将发酵液以8 000 rpm离心10 min，取上清，缓慢加入3 倍体积的无水酒精（边加入边搅拌），4 ℃静置2 h后15 000 rpm离心10 min，收集所得沉淀，经冷冻干燥后称重即得可溶性胞外多糖的量[13]。

1.3.7 同心圆形花样牛奶布丁的制备

取上述种子液按1:50的比例分别转接入A、B、A+B的培养体系中。在30 ℃，180 rpm条件下培养30 h。取上述30 h的培养物（Medium A、A+B和B，依次定义为组1、组2、组3）经过巴氏杀菌（72 ℃，15 min）后按照A、A+B、B的顺序依次倒入品尝杯中。

2 结果与分析

2.1 肠膜明串珠菌BD3749在脱脂乳介质中的生长情况

由图1可以看出，pH反映其产酸情况，CFU值表征其活菌数的增加。在发酵前3 h，肠膜明串珠菌BD3749在脱脂乳介质中生长缓慢，尚处在发酵初期，主要以积累菌体生物量为主；在3~12 h，随着发酵时间的延长，增殖速率急剧加快，生长达到了对数期；在12~24 h，增殖速率放缓，进入了稳定期，活菌数由达到log7.45 CFU/mL的极值；在随后的24~72 h的时段内，增殖速率开始缓慢下降，进入了衰亡期，活菌数降至log7.3 CFU/mL。而产酸情况由发酵开始时的pH 7.3至发酵72 h时的5.75。由此可知，发酵时间从0~24 h内，肠膜明串珠菌BD3749生长良好，随着发酵时间的延长，产酸能力增强，在脱脂乳中有一定生长及产酸能力，这对终产品的凝固成型是由有贡献的。

图1 肠膜明串珠菌BD3749 在脱脂乳中介质中的生长情况

2.2 肠膜明串珠菌BD3749在番茄汁介质中的产糖情况

图2是BD3749在番茄汁介质中的产糖情况，可以看出随着发酵时间的延长，蔗糖浓度逐渐降低，EPS产量逐渐增加，当蔗糖溶度降低到1.6%时，EPS产量达到了18.4 g/L。作为多糖合成代谢作用的直接底物，蔗糖的浓度与肠膜明串珠菌BD3749多糖产量息息相关，蔗糖含量由5%降低到1.6%，反映了其对碳源的利用情况，是衡量其生长的一个重要指标，说明蔗糖被充分利用，EPS产量是形成终产品的主要因素。pH则反映其产酸情况，从发酵开始时的pH 7.0至发酵达到72 h时，pH降到4.0，说明随着发酵时间的延长，BD3749在番茄汁介质中的产酸能力也逐渐增强，这对终产品的成型也有重要贡献，因为酸度可以导致介质混合后发生凝乳，从而达到成型的效果。

图2 肠膜明串珠菌BD3749在番茄汁介质中的产糖情况

2.3 基于肠膜明串珠菌BD3749发酵的同心圆形花样奶布丁

由图3可以看出，图A为脱脂乳-番茄汁培养基（Medium A+B）混合杀菌后将尚未凝结的布丁倒入容器中；图B为成型的花样奶布丁。本试验对肠膜明串珠菌BD3749发酵产物杀菌冷却后，将两种发酵产物倒入同一个容器中，可以获得不同形式的花样奶布丁，不含食品添加剂营养又健康的同时，使得奶布丁的产品形式多样化，增加了产品的趣味性。

图3 基于肠膜明串珠菌BD3749的同心圆形花样奶布丁

3 结论

本试验以脱脂乳和番茄汁为介质的、基于肠膜明串珠菌的发酵特性，将肠膜明串珠菌BD3749应用于制备花样奶布丁，通过植物来源的果汁与动物来源的牛奶的结合，将植物营养和丰富的乳蛋白融合到一个产品中，且制备工艺简单，对营养物质的损伤小，既保留了牛乳中的营养成分，又富含抗氧化性成分和葡聚糖型膳食补充剂（含量为8 g/L），并且无需添加其他添加剂，仅通过发酵产物就可以自然成型，制得营养又健康的奶布丁，很好的契合了当下消费者对于食品的高品质需求。此外，该款产品利用了肠膜明串珠菌发酵产生的葡聚糖在质构及保水性方面的特点，可以实现在产品形式上的花样化，在美味、营养和健康的基础上，同时又增加了这一类产品的趣味性。