钟锰 王晓娇 王君 刘畅 朱彬 王鹤 李英夫 何伟明

(1内蒙古民族大学附属医院神经外科，内蒙古 通辽 028007；2内蒙古医科大学基础医学院；3佳木斯大学第一附属医院神经外科)

中心体是细胞中的主要细胞器之一。一个中心体包括2个中心粒及其周围的中心粒周围物质，参与有丝分裂过程中纺锤体的组装及细胞分裂。研究发现染色体不稳定性和中心体扩增异常是肿瘤细胞普遍具有的特征，通常出现在肿瘤发生的早期阶段，这为肿瘤早期诊断和治疗提供了新途径〔1～3〕。STIL基因最早发现于急性T细胞淋巴白血病基因重排，命名为SIL/STIL〔4〕,STIL与生物体内中心体的生成、复制及细胞有丝分裂密切相关。但目前关于STIL在神经胶质瘤中表达及其分子机制尚未见报道。本文探讨STIL在神经胶质瘤中表达及生物学意义。

1 材料和方法

1.1生物信息学分析 公用数据库癌症基因组图谱(TCGA)在线分析STIL在神经胶质瘤中表达水平。

1.2临床样本 20例神经胶质瘤临床标本中男女各10例；年龄46～69岁，平均(57.25±7.58)岁。浸润周围脑组织6例，无浸润14例；临床分期：Ⅰ+Ⅱ期8例，Ⅲ+Ⅳ期 12例。

1.3细胞系 分别检测几株常用神经胶质瘤细胞系中STIL中的表达，神经胶质瘤细胞系SHG-44、U87、SWO-38及U251与神经胶质细胞系NHA。

1.4STIL蛋白检测 利用siRNA干扰技术瞬时敲低胶质瘤细胞系中STIL的表达水平，并利用Western印迹检测STIL蛋白水平。

1.5主要试剂 染色体凝缩蛋白复合物工的亚基(NCAP)D2抗体购自美国Abcam公司(货号：ab34338)，免疫组织化学试剂盒、磷酸盐缓冲液(PBS)、 柠檬酸缓冲液、苏木素染剂和二氨基联苯胺(DAB)显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司，DMEM培养液、 胎牛血清(FBS)和青霉素/链霉素均购自美国Gibco公司。

1.6免疫组化染色 将组织芯片从4℃冰箱中取出置于室温下 30 min后于65℃烤箱烤片1 h，二甲苯、 乙醇梯度脱蜡、水化，将组织芯片置于微波加热的1%柠檬酸缓冲液中水浴行抗原修复至室温；PBS洗涤3次，每次3 min；滴加过氧化氢(H2O2)溶液，室温温育20 min；PBS洗涤组织芯片3次，每次3 min；滴加一抗 NCAPD2(稀释浓度为1∶75)，4℃冰箱温育过夜；第2天，取出组织芯片，室温放置30 min，PBS洗涤组织芯片3次，每次3 min；滴加二抗试剂，室温下温育30 min；DAB显色；苏木素染剂复染，中性树脂胶封片。PBS替代一抗作为阴性对照。

1.7四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测细胞增殖 取对数生长期神经胶质细胞按5 000个/孔接种于96孔板，培养过夜后进行siRNA转染，每组设4个复孔，培养1、2、3、4 d后，每孔加入0.5%MTT溶液20 μl，继续培养4 h，弃上清后加入200 μl 二甲基亚砜(DMSO)，室温下振荡10 min，使结晶物全部溶解，以酶标仪检测各孔490 nm处的吸光度(OD值)。

1.8Western印迹 使用放射免疫沉淀试验(RIPA)裂解液裂解所收集细胞；提取细胞蛋白后采用二喹啉甲酸(BCA)法检测蛋白浓度；采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对蛋白进行电泳分离后转膜至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上；使用脱脂牛奶封闭 2 h；于4℃冰箱温育一抗过夜；采用洗膜缓冲液(TBST)洗膜后温育二抗2 h；使用电化学发光(ECL)曝光液曝光。

1.9统计学方法 采用SPSS25.0软件和GraphPad Prism7.0软件进行单因素方差分析及t检验。

2 结 果

2.1STIL在神经胶质瘤中表达水平 SITL在神经胶质瘤组织中表达(4.50±4.21)显著高于正常组织(0.50±1.00)。检测的20例神经胶质瘤临床标本发现STIL在胶质瘤中高表达，与TCGA数据库分析结果一致(图1)。TCGA数据库分析显示STIL高表达与神经胶质瘤患者低生存期相关(图2)。

图1 STIL在神经胶质瘤临床标本中表达

图2 STIL表达与神经胶质瘤患者生存期相关性

2.2STIL在不同神经胶质瘤细胞系中表达 与人正常星形胶质细胞NHA mRNA(1.00±0.08)相比，STIL在细胞系U251、SHG-44、SWO-38细胞中均表达(1.75±0.04、2.15±0.04、2.41±0.20)明显高，在细胞系U87细胞中表达最高(3.58±0.09)。

2.3构建STIL低表达神经胶质瘤细胞系 sh-STIL-1组SHG-44细胞和SWO-38细胞STIL蛋白水平(0.68±0.05，0.81±0.08)均显著低于sh-NC组(1.00±0.05，均P<0.05)。见图3。

2.4敲低STIL表达有效抑制神经胶质瘤细胞的增殖能力 第2天后，sh-STIL-1组SHG-44细胞和SWO-38细胞增殖能力均显著低于Sh-NC组(P<0.05)。见表1、2。

图3 Western印迹检测STIL的敲低效率

2.5敲低STIL表达导致神经胶质瘤细胞内基因组不稳定性 通过免疫荧光实验分析发现敲低STIL的表达水平后，紫外诱导胶质瘤细胞SWO-38内产生基因组DNA双链断裂数目明显增多，导致基因组不稳定的发生(图4)。

表1 两组SHG-44细胞增殖能力比较

表2 两组SWO-38细胞增殖能力比较

图4 敲低STIL导致胶质瘤细胞基因组DNA双链断裂增多(免疫组化，×40)

2.6敲低STIL的表达对p27蛋白水平影响 敲低STIL的表达导致p27蛋白水平上调(图5)。

图5 敲低STIL导致胶质瘤细胞p27表达上调

3 讨 论

神经胶质瘤是神经外科常见的原发性恶性脑肿瘤，其发病率约占所有颅内原发性脑肿瘤的50%以上〔5〕。世界卫生组织(WHO)根据神经胶质瘤的恶性程度将其分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ类，分级越高，恶性程度越高，预后越差〔6〕。目前，临床上存在的高分级胶质瘤患者，如间变性星形胶质瘤及胶质母细胞瘤等，尽管存在手术、化疗及放疗等治疗手段〔7〕，但由于胶质瘤具有局部侵袭性生长且生长迅速、易复发、手术易残留具有强浸润性的肿瘤细胞、无法完全切除、高度异质性等特点，导致胶质瘤患者的累积1年生存率低于30%，高级别胶质瘤患者的中位生存期仅不足12个月〔8,9〕。此外，与其他部位的肿瘤相比，胶质瘤对常规化疗、放疗反应不敏感。由于血脑屏障存在，化疗药物及抗肿瘤药物的疗效也受到限制。因此，如何控制疾病的复发、筛选有效的诊断和治疗靶点一直是神经外科的焦点。

近年来随着神经胶质瘤的研究逐渐深入，学者们发现神经胶质瘤的发病涉及一系列相关基因和蛋白表达水平的改变，包括癌基因的活化及抑癌基因的抑制。癌症基因组图谱计划通过对206例神经胶质瘤临床样本大规模遗传学分析发现神经胶质瘤中众多基因发生突变，主要涉及3条信号通路：酪氨酸激酶受体RTK/RAS/PI3K通路、p53通路及RB信号通路。其中，p53通路通过以p53为核心的调控网络监控DNA损伤，募集损伤蛋白以维持基因组的完整性，P53的失活与神经胶质瘤的发生密切相关〔10〕。此外，随着非编码RNA领域的研究不断深入，有报道发现长链非编码RNA、miRNAs也参与了胶质瘤的发生发展过程〔11，12〕。然而，尽管神经胶质瘤发病机制的研究取得了一些进展，但目前仍未全面揭示其发病的具体机制，临床也无有效的肿瘤标志物。因此，神经胶质瘤发生的机制仍需进一步阐明，寻找新型特异性肿瘤标志物对于预测胶质瘤的预后和复发至关重要。

STIL具有保守的蛋白相互作用区域，其中CR2(氨基酸385-499)是富含脯氨酸的结构域，含有保守的PPXXPXP基序，能与中心体P4.1相关蛋白CPAP/CENPJ相关作用。而超螺旋结构域(氨基酸721～748)对polo样激酶(PLK)4及细胞周期依赖性激酶(CDK)1/细胞周期蛋白B2，3至关重要〔13〕。此外，STAN结构域(氨基酸1 052～1 148)介导中心体蛋白(SAS)-62的结合〔14〕。STIL羧基端的KEN盒参与APC/C介导的STIL5降解，也能与Hedgehog 信号通路中的保守分子丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶抑制剂(SUFU)6及家族锌指蛋白(GLI)17相互作用〔15,16〕。

研究发现在细胞分裂过程中，STIL与其结合蛋白相互作用，确保中心体复制的保真性以减少染色体不稳定性的发生〔17〕。中心体数目或结构异常能影响细胞分裂过程，而STIL在维持增殖细胞中心体完整性方面至关重要。研究表明在多种预后不良的肿瘤中STIL存在异常表达，包括肺癌、结肠癌及卵巢癌等〔18～20〕。STIL的表达水平与多种肿瘤的转移潜能密切相关〔20〕。STIL发挥着原癌基因的作用，通过促进纺锤体缺陷引发染色体不稳定性，最终导致肿瘤发生〔21〕。另外，大量文献报道STIL参与调控音猬因子(SHH)信号通路也可能与肿瘤发生发展相关〔22〕。在胰腺癌中过表达STIL可抑制SUFU介导的GLI1蛋白表达，而敲低STIL可逆转上述表型。STIL过表达促进GLI1转录活性增强，而GLI1的表达水平上调能促进细胞持续增殖、细胞死亡抗性、血管生成及基因组不稳定性。因此，有研究推测STIL的过表达通过调控GLI1的功能引发癌变〔23〕。作为癌基因，STIL为预后做出更准确的评估及进行分子靶向治疗提供了可能。有报道指出通过抑制STIL能有效增强DNA损伤化疗药物在治疗卵巢癌中的功效〔19〕。Patwardhan等〔24〕检测了多种肿瘤组织芯片发现STIL在肺癌组织中显著高表达，其表达与着丝点基因的表达及有丝分裂相关。

截至目前，神经胶质瘤的发生发展机制仍不清楚，STIL在神经胶质瘤发生发展中的作用机制尚未有相关文献报道，而寻找有效的肿瘤标志物及治疗靶点极为迫切。本研究证实了敲低STIL表达能有效抑制神经胶质瘤细胞的增殖能力，但其分子机制有待进一步探究。

综上，神经胶质瘤中STIL呈高表达，与临床分期呈正相关，并参与细胞周期及 DNA修复等过程，有望成为神经胶质瘤诊疗的新分子靶标。