王凯悦，邵心依，顾学芳，姚 勇，田澍

（南通大学 化学化工学院，江苏 南通 226019）

莱克多巴胺是一种β-肾上腺受体激动剂，临床上用于治疗支气管哮喘、充血性心力衰竭症等疾病[1]。另外，莱克多巴胺可控制蛋白质合成，实现动物营养的再分配，提高瘦肉率[2]，俗称“瘦肉精”。然而，肉制品中的过量残留可导致食用者出现肌肉震颤、心悸、恶心和呕吐等症状[3]。尽管莱克多巴胺作为饲料添加剂在我国和欧盟早已被严格禁止，但非法添加事件仍时有发生。因此，建立一种简便、灵敏的莱克多巴胺检测方法具有重要意义。

色质联用方法及酶联免疫法是最常用的莱克多巴胺检测方法[4-6]。免疫分析法可结合诸如比色法、荧光法、电化学和表面增强拉曼（surface-enhanced Raman scattering，SERS）等读出方法[7-10]，因其特异性和灵敏度高，已成为食品、环境和生物领域应用最广泛的分析方法之一。SERS 是指当分子位于金、银等贵金属粗糙表面附近时，其拉曼信号得到极大增强的现象。近年来，基于SERS 的免疫分析受到越来越多的关注，其超高灵敏度和光谱分辨率，单一光源下检测多组分的能力，以及水分子可忽略的微弱信号使得SERS 尤其适合于生物领域的分析[11-14]。

金纳米颗粒具有良好的生物相容性，银纳米颗粒则具有极强的SERS 增强效果，因而金、银纳米颗粒成为生物分析中最常用的SERS 基底[15]。然而，在实际应用中，金、银纳米颗粒的大小以及聚集状态的不确定性影响了定量分析结果的准确性和可信度[16]。为此，制备规整的二维或三维金属纳米阵列是较好的解决方案[17-18]。首先，金属纳米颗粒之间的强电磁耦合会使长程纳米阵列结构的SERS 增强效果显著提升；其次，通过控制周期性有序纳米结构的形貌，可以使金属表面的局域表面等离子体共振（local plasmon resonance frequency，LSPR）在可见光甚至近红外区域内实现调谐[19]。这对于SERS 在生物分析中的应用尤为重要，因为该区域可以有效避免荧光干扰和光诱导的生物变性。

本文以密堆积的二维聚苯乙烯（PS）微球为模板，采用电沉积方法（多电流阶跃）制备了金/银双金属球腔阵列（bimetallic cavity arrays，BMCA），该基底展示出极佳的SERS 增强效果和信号重复性。将BMCA 基底与竞争免疫分析相结合，对标准溶液和猪肝样品中的莱克多巴胺进行高通量的初步筛选和定量分析。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

莱克多巴胺（RAC）、亚甲基蓝、3，3′，5，5′-四甲基联苯胺（TMB），sigma-Aldrich；硝酸银（AgNO3）、氯金酸（HAuCl4），百灵威（J&K）；其余试剂均为分析纯。用于负载标记分子的DNA 订购自上海生工生物技术有限公司（Sangon Biotech，Shanghai），其序列如下：

包被抗原RAC-OVA 及单克隆抗体anti-RAC由苏州大学邓安平教授课题组提供。抗体效价1∶10 000，最优条件下基于该单克隆抗体对RAC 的IC50 为0.56 ng/mL，LOD 为0.049 ng/mL。所有溶液均采用电阻率大于18.2 MΩ·cm 的超纯水配制。CHI660E 电化学工作站（上海辰华）及Hitachi S-4700 场发射扫描电子显微镜（SEM）分别用于金银球腔阵列的制备和形貌表征，岛津UV-3600 用于测量球腔阵列的反射紫外光谱，Raman 测量则采用Horiba iHR320 共聚焦显微拉曼光谱仪（Jobin Yvon technology），激发光波长为633 nm，采用D2 衰减片，使到达样品表面的激光功率为0.1 mW。

1.2 实验方法

1.2.1 金银双金属阵列基底的制备

聚苯乙烯微球模板及电沉积方法见本课题组早期工作[17-18，20]。为实现金银纳米颗粒的同时沉积，电解液组成略作调整：以浓氨水调节不同体积的0.1 mol/L AgNO3+0.1 mol/L EDTA 溶液pH 为10.0，缓慢滴加0.1 mol/L HAuCl4溶液，使电解液金银组分总浓度为0.05 mol/L。

1.2.2 金纳米探针的制备

向预先制备的金溶胶中滴加适量0.2 mol/L 的Na2CO3，调节溶液pH 为9.0～9.5。随后向1 mL 金溶胶（柠檬酸钠还原氯金酸制得）中加入200 μL 50 μg/mL 的anti-RAC，室温下孵育0.5 h 后加入50 μL 40 μmol/L 的CDNA，4 ℃下孵育过夜。离心去除多余的抗体和捕获DNA，重新分散于pH=8.0 的tris-HCl 缓冲溶液中。随后，加入20 μL 10 μmol/L的TDNA并在37 ℃下孵育1 h，加入20 μL 10 μmol/L的TDNA和SDNA混合液，4 ℃反应12 h 以形成DNA多联体。再次离心去除多余的DNA，随后加入100 μL 1 mmol/L TMB 溶液，吸附反应2 h 后离心去除多余的TMB 并重新分散于tris-HCl 缓冲溶液备用。

1.2.3 RAC 免疫传感器的构建

将10 μL 50 μg/mL RAC-OVA 滴加于BMCA表面指定区域，4 ℃下静置24 h。然后，将20 μL 含有金纳米探针和不同浓度的RAC 标准溶液（真实样品溶液）滴加至覆盖有包被抗原的区域，室温下反应1 h。免疫竞争反应后，滴加20 μL 银溶胶于上述区域银染反应1 h，银纳米颗粒则因静电相互作用吸附至免疫复合物表面。

1.2.4 真实样品的处理

将准确称重的猪肉或猪肝样品（2～3 g）切割并充分均质化，加入10 mL 甲醇超声搅拌30 min。然后将样品在4 ℃下10 000 r/min 离心15 min，取上清液以tris-HCl 缓冲溶液稀释定容至100.00 mL。于稀释提取液1.0 mL 中加入一定量的RAC 标准溶液，这些不同浓度的加标样品用于SERS 检测。

2 结果与讨论

2.1 金/银双金属球腔阵列基底的制备和表征

自组装是一种制备阵列结构的简便有效的方法。由SEM 图（图1（a））可见，二维PS 模板由水面转移至ITO 电极表面后仍保持着高度有序的阵列结构。在平方厘米面积范围内PS 微球呈单层分布，未出现明显的位错缺陷和多层堆积。倾斜视图进一步证实了模板的规整性。图1（b）所示为电沉积和去除PS 模板后所得的BMCA 的SEM 图。多电流阶跃法中的大电流脉冲用以生成粒径细小的纳米“种子”，而小脉冲则使金/银金属在其上有序生长，并能通过控制小脉冲次数实现对球腔形貌的控制[17-18]。该方法的优点在于可以通过控制电沉积过程中所通过的电量（小脉冲的次数）实现对所得球腔形貌的控制。由图可见，球腔阵列保持了模板的原始形貌特征。EDX 能谱证明了在BMCA 中共存有Au 和Ag 两种金属，而XRD 图则表明了组成球腔的多晶金/银纳米颗粒具有面心立方（fcc）结构和（111）择优取向。为进一步分析阵列基底中金、银元素的分布，对其进行EDX 元素面扫描（图1（c））。由图可见，Au 和Ag 原子均匀分布在腔阵列表面，两种元素的叠加清晰地反映了BMCA 的形貌。

图1 双金属球腔阵列基底的形貌表征及元素成分分析Fig.1 Morphological characterization and element composition analysis of gold/silver bimetallic cavity arrays

图2 所示SEM 图阐明了电解液中HAuCl4与AgNO3摩尔比（nAu∶nAg）对BMCA中金、银元素组成及形貌的影响。当nAu∶nAg>8∶2 时，SEM 图中只观察到一些散乱的金属颗粒，这可能是因为此时Au（III）处于一种欠电位沉积的状态，而银虽然能够实现电沉积，但由于含量过低，无法在模板缝隙里形成规整的阵列结构。随电解液中AgNO3含量逐渐增大（nAu∶nAg由8∶2 连续改变为5∶5），球腔阵列的形貌变得愈发清晰。继续增大电解液中nAg，球腔的规整性反而降低，直至出现大量的银纳米颗粒覆盖在阵列基底的表面。BMCA 阵列中金、银的原子分数也随电解液不同组成而明显变化。经EDX 分析估算可得，随电解液中nAu∶nAg由8∶2 变为6∶4，所得BMCA中金原子的比例（从70.1%到24.2%）迅速下降。然而，当电解液中Au（III）和Ag（I）的浓度接近相等时，这种下降趋势会减慢。继续增加电解液中Ag（I）的含量（nAu∶nAg<3∶7），最终的BMCA 基本由银构成（银含量为98.1%）。

图2 不同nAu∶nAg 电解液制得的双金属球腔阵列的扫描电镜图Fig.2 SEM images of BMCA obtained from electrolytes with different nAu∶nAg

2.2 BMCA 基底的SERS 性能

为进一步阐明BMCA 的组成与其表面的LSPR及拉曼增强效果之间的联系，以确定最佳制备条件，制备了一系列不同组成的阵列基底，测量了它们的紫外-可见反射光谱（此处将纵坐标由反射率转为吸收以方便观察）及亚甲基蓝在其表面的SERS 信号。由图3（a）可见，随电解液中银含量增加，较短波长处连续红移的吸收峰代表了银的LSPR，意味着BMCA 中银含量和银纳米粒子尺寸的增加；长波长处的吸收峰则代表了BMCA 中金、银纳米颗粒耦合产生的LSPR，随着金在阵列结构中原子分数的增加，LSPR 也呈现红移趋势和增强。图3（b）为亚甲基蓝在对应基底上的SERS 光谱。正如预期的那样，SERS 强度随着基底中银比例的升高而增强。当电解液中nAu∶nAg=2∶8 时，所得BMCA 表面亚甲基蓝的SERS 信号最强，然而其信号重现性也最差（相对标准偏差RSD=21.9%）。相比之下，当选择nAu∶nAg=6∶4 的电解液来制备BMCA 时，亦可得理想的SERS 增强效果。更重要的，阵列结构基底制备的可重复性和形状的规整性是获得良好的信号重现性并保证结果可信度的基础。为此，我们通过保持电沉积电量一致的方法平行制备了4 个阵列基底，并在每个基底表面随机选取15 个测试点，测试了吸附于其上的TMB 分子的SERS 信号，对应图谱以二维拉曼图的形式表示（图3（c））。由图可见，在4 个基底表面所获得的信号展示出令人满意的重现性（RSD=9.4%），证明了该制备方法的高度可重复性。与此同时，在同一基底上以亚甲基蓝为探针分子，随机选取30 个测试点，同样将对应图谱以二维拉曼图的形式表示出来（图3（d）），所得结果证明了基底具有极佳的表面规整度。以苯硫酚钠为探针分子，按式（1）[21]对所得BMCA 基底的增强因子进行计算，结果为6.7 × 106。

图3 金/银双金属球腔阵列基底的局域等离子体共振及其SERS 性能Fig.3 Localized plasmon resonance and SERS performance of gold/silver bimetallic cavity arrays

2.3 实验条件的优化

利用单因素优选法，分别以1 ng/mL RAC 溶液和空白溶液为考察对象，通过对比不同条件下传感器信号强度，确定金免疫探针和竞争性免疫传感器的制备条件。本工作中，金纳米颗粒表面的DNA 链节连环起到信号放大器的作用。在这一策略中，CDNA通过末端的巯基共价键合至金纳米颗粒的表面，带有特定序列的SDNA和TDNA的两个互补区域杂交后，引发杂交反应。TMB 属于芳香族阳离子染料，可以通过与带负电荷的磷酸基团之间的静电作用吸附于DNA 表面，或直接嵌入DNA 双螺旋中实现对纳米探针的标记[22]，从而增加标记分子的负载量而使信号得到极大增强。由图4（a）可见，随着CDNA浓度的增加，SERS 强度显著增加并在浓度为2.0 μmol/L时达到最大值。图4（b）所示的抗RAC 浓度与所得信号强度变化趋势图（4（a））相似，在浓度为10.0 μg/mL时达到最大值。进一步增加抗体或CDNA的浓度导致免疫传感器的强度略有下降，这可能是由于抗体与DNA 在AuNPs 表面的竞争吸附所致。包被抗原和免疫探针的浓度则以空白溶液为考察对象加以确定。如图4（c）所示，SERS 强度随着包被抗原浓度的增加而逐渐提高，直到在100 μg/mL 时达到稳定，表明此时包被抗原在BMCA 表面达到饱和吸附。免疫探针浓度（图4（d））在0.5～2.5 nmol/L 范围内变化趋势与图4（c）相同，当免疫探针浓度大于3.0 nmol/L时达到最大值并趋于稳定。在随后的实验中，将包被抗原和免疫探针的最佳浓度分别设为100 μg/mL和3.0 nmol/L。

图4 竞争免疫传感器构建条件的优化Fig.4 Optimization of construction conditions of the ractopamine competitive immunosensor

2.4 RAC 的定量分析

为了考察该RAC 竞争免疫传感器在定量检测中的可行性，首先以打孔的双面胶覆盖BMCA 表面，暴露出若干（3 × 6）直径为2 mm 的圆形区域，用于进行样品的预筛查和定量分析。此操作可帮助我们在同一基底表面获得若干平行测定数据，从而提高数据的重现性。继而配制不同浓度的RAC 标准溶液，按实验步骤进行相应处理，测量标记分子TMB 的SERS 信号，结果见图5（a）。由图可见，TMB的拉曼信号随RAC 浓度的增加持续衰减。以SERS强度与待测物浓度对数值进行作图和线性拟合后得相应标准曲线（图5（b））。其中，每一个数据点及误差棒分别代表5 个随机测量点SERS 强度的平均值及标准偏差。可以看出，在10 pg/mL 到100 ng/mL 浓度范围内，RAC 浓度的对数值与TMB分子1 608 cm-1处SERS 峰强度存在线性关系，线性方程为y=4 835.4 -2 568.7lg[C]，方法的检出限低至3.0 pg/mL。

图5 莱克多巴胺浓度与SERS 强度的线性相关性Fig.5 Linear correlation between ractopamine concentration and SERS intensity

选择溴布特罗、克仑特罗和西马特罗为干扰物对方法的特异性进行评估，测试了不同浓度（0.1，1.0 和10.0 ng/mL）的RAC 和干扰物的混合液。结果表明，随着RAC 浓度的增加，观察到SERS 强度显著降低，而随着干扰物浓度的增加，信号没有明显变化。RAC 在1.0 和5.0 ng/mL 浓度下的批内测定（n=6）的相对标准偏差（RSD）分别为7.7%和9.3%。同时，在平行制备的BMCA（n=4）上，RAC 的批间RSD（1.0 和5.0 ng/mL）分别为10.4%和9.1%。以上结果表明，该方法具有良好的特异性和精密度。

2.5 真实样品的检测

以本地菜市场售卖的猪肝为真实样品，按实验方法进行筛查，未见RAC 检出。进而，往样品中添加0.1，0.4 和2 ng/mL 的RAC，通过计算回收率来验证这种竞争性免疫测定法的准确性，结果见表1。计算结果表明，该方法的回收率为94.7%～107.8%，RSD 为8.9%～11.7%（n=5）。这些结果表明，该竞争免疫分析方法具有较高的准确性和可靠性，可用于测定实际样品中的痕量β-肾上腺受体激动剂。

表1 方法用于检测真实样品中RAC 的加标回收率Tab.1 The recoveries of the proposed immunoassay for the detection of RAC in spiked samples

3 结论

以密堆积聚苯乙烯微球为模板，结合电沉积方法，制备了高度有序的二维金/银双金属球腔阵列。通过改变前驱体中金、银组分的摩尔比，可以实现对该阵列基底形态和组成的调节，从而在其上获得优异的SERS 增强和信号重现性。固定于免疫金纳米探针表面的DNA 杂交链用作信号放大器以吸附带正电荷的标记分子。在10～100 ng/mL 的浓度范围内，标记分子TMB 的拉曼信号与RAC 浓度的对数值呈负线性相关，其检出限为3.0 pg/mL。该方法可用于市售肉制品中莱克多巴胺的定性定量测定。另外，制备更多材质的有序球腔阵列结构有利于开展基于SERS 的理论研究；结合DNA 杂交链对标记分子的负载方式以及SERS 的高灵敏度和多路复用特性，有望将该方法拓展至对大分子蛋白的高通量检测及对生物小分子代谢的监测。