乔克威，滕进婧，周小云，李健，刘明新，杨华*

（1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.湖南省农作物种质创新与资源利用重点实验室，湖南 长沙 410128）

MLP 蛋白是一种神秘果素类似蛋白[1]。1995年，MASUDA 等[2]在神秘果果实中克隆了该神秘果素基因；2006 年，TSUKUDA 等[3]从粗皮柠檬（Citrusjambhiri）中克隆了RlemMLP2和RlemMLP3 基因；2010 年，GAHLOTH 等[4]从月橘中克隆了MLP基因。SO-ICHIRO 等[5]发现葡萄MLP 蛋白对胰蛋白酶有抑制作用。李梦芸[6]对金柑进行冷驯化，发现随着冷驯化时间的延长，金柑中MLP2–2基因的相对表达量上升，认为该基因在金柑冷胁迫响应过程中起作用。对MLP2–2基因进行生物信息学分析，发现MLP2-2 蛋白与豆类Kunitz 蛋白家族蛋白酶抑制剂同源性较高。大部分芸香科植物中都含有Kunitz 蛋白，该蛋白可以对细胞内蛋白酶活性进行调控[7]，抑制植物内源性蛋白活力，阻止蛋白的降解[8]。对MLP2–2基因的生物信息学分析也预示MLP2-2 蛋白与胰蛋白酶存在互作。为验证MLP2-2蛋白在金柑冷胁迫中对蛋白酶的抑制功能，笔者对金柑进行冷驯化，促使金柑体内MLP2–2基因表达后提取叶片RNA，反转录获得cds 序列，以构建pBRT7- MLP2-2 过表达载体，并转入Rosetta（DE3）大肠杆菌进行工程菌表达，以获得目的蛋白MLP2-2；将获得的纯化蛋白添加到正常金柑叶片总蛋白提取液中，以金柑叶片总蛋白降解率的变化来验证MLP2-2 蛋白对金柑叶片总蛋白中蛋白酶的抑制作用。现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 材料

2 年生金柑苗由湖南农业大学柑橘改良中心提供；过表达载体质粒购于武汉伯远生物科技有限公司；大肠杆菌DH5α 购自天根生化公司。

RNA 提取、反转录、切胶回收和蛋白浓度检测等试剂盒均购自擎科生物科技有限公司；Rosetta（DE3）大肠杆菌工程菌、Binding buffer、Washing buffer、Elution buffer 均购自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1MLP2–2基因的生物信息学分析

运用NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）分析MLP2-2 蛋白氨基酸序列和保守结构域；采用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）分析MLP2-2 蛋白跨膜结构；利用SWiSS-MODEL（http://swissmodel.expasy.org/）分析MLP2-2 蛋白构型等信息。

1.2.2 金柑MLP2–2基因的克隆与载体构建

根据NCBI 数据库MLP2-2 同源蛋白编码序列（登录号为AB213396.1），全长672 bp，编码223 氨基酸残基，运用SnapGene 软件设计其cds 区域的PCR 引物，上游引物，5'-ATGAAGATTTCATTAGC AACAACAC-3'；下游引物，5'-TTACACAGACGTT GATCTTTCTG-3'。

冷驯化金柑幼苗，提取叶片总RNA，反转录获得cDNA 序列[9]。PCR 扩增目的基因，凝胶电泳分离产物，检测目的条带。切胶回收MLP2-2 条带，经北京擎科生物技术有限公司测序比对后侵染DH5α，用含有卡那霉素的抗性培养基培养大肠杆菌，挑选单克隆抗体，用LB 培养基进行扩增，提取质粒。将菌落PCR 产物送往北京擎科生物科技有限公司测序。

1.2.3 MLP2-2 蛋白表达及检测

参照ZHAO 等[10]的方法，将重组质粒转染Rosetta （DE3）感受态细胞。参照李锁[11]的方法，诱导蛋白表达。参考汪家政等[12]的方法，采用镍柱纯化蛋白，采用SDS-PAGE 检测蛋白的相对分子质量、蛋白浓度及杂蛋白含量，采用Western Blot 检测MLP2-2 蛋白表达。

1.2.4 金柑蛋白降解率的检测

液氮研磨金柑叶片至粉末，取0.5 g 粉末，添加1 mL PBS 缓冲液，冰浴30 min，其间每隔5 min振荡混匀1 次。4 ℃、20 000 r/min 离心30 min，取上清再次离心，上清液备用。分2 组各取100 μL蛋白提取液，对照组加入1 μL ddH2O，测试组加入1 μL MLP2-2 蛋白，25 ℃孵育，分别在10、20、30 h 取样，使用BCA 蛋白浓度检测试剂盒，检测样品中的蛋白浓度。

2 结果与分析

2.1 金柑MLP2-2 基因的结构特征

依据NCBI 网站对MLP2–2分析发现，MLP2-2蛋白的氨基酸序列为：MetKISLATTLSFLILALASN SLLVLGTSSVPEPLLDVNGNKVESTLQYYIVSAI WGAGGGGVSLHGGRNGYCPLDVIQLPSDTQNG IKLTLSPYNNSTIVRESADLNLRFSVLLSGRDYC NEQPLWKVDNYDAASGKWFITTGGLDGHPGAE TLLNWFKLEKIGNFPGTYKIVHCPSVCESCVKLC NNVGRSFEDGVRRLVLVRDDEPAFPVVLIPATER STSV。

对序列进行cds 保守区段预测，结果（图1-a）发现该蛋白存在反应位点环结构，同时与豆类Kunitz蛋白酶抑制剂同源性较高。

运用TMHMM 软件分析MLP2-2蛋白序列, 结果（图1-b）发现，MLP2-2 蛋白存在2 个跨膜结构区，属于多次跨膜蛋白。

运用SWISS-MODEL 软件对MLP2-2 蛋白序列进行分析，发现该蛋白由2 个亚基构成，与胰蛋白酶抑制剂有同源性（图1-c）。

图1 MLP2-2 蛋白结构的预测结果Fig.1 Structure analysis of MLP2-2

2.2 pBRT7-MLP2-2 过表达载体

将PCR 产物送样测序，测序结果表明与NCBI数据库中目的基因一致。将测序后的MLP2–2基因片段转入质粒pBRT7，构建pBRT7-MLP2-2 表达载体，转化至大肠杆菌感受态细胞，随机挑选18个阳性菌株摇床培养，提取菌液进行PCR 鉴定。结果如图2 所示，除2、3 号菌株外，均扩增出目的条带，说明其余16 个菌株均成功转入MLP2–2基因。测序结果与MLP2-2 基因序列一致，表明pBRT7-MLP2-2 过表达载体构建成功。载体结构如图3 所示。

图2 pBRT7-MLP2-2 原核表达载体的菌落PCR 验证Fig.2 Verification of the pBRT7-MLP2-2 prokaryotic expression vector by colony PCR

图3 pBRT7-MLP2-2 原核表达载体图谱Fig.3 Map of the pBRT7-MLP2-2 prokaryotic expression vector

2.3 MLP2-2 蛋白融合表达情况

收集菌液，分别对诱导前总蛋白、20 ℃培养菌上清液、20 ℃培养菌体沉淀、37 ℃培养菌上清液、37 ℃培养菌体沉淀等5 组进行SDS-PAGE 蛋白凝胶电泳检测，检测目的蛋白位点和表达量。如图4-a所示，目的蛋白主要集中于菌体沉淀中，当培养温度在37 ℃时，目的蛋白相对表达量较高。

收集菌液沉淀，分别对孵育流出液、洗杂流出液、洗脱流出液等组分分组处理，制备样品，进行蛋白质凝胶电泳，结果发现，孵育流出液和洗杂流出液样品特异性较低。对不同浓度洗脱液组分分析发现，当洗脱液中咪唑浓度为500 mmol/L 时，蛋白样品特异性强，洗脱效果最好，蛋白浓度最高（图4-b）。

图4 His-MLP-2-2 融合蛋白表达及镍琼脂糖亲和层析纯化SDS-PAGE 分析Fig.4 SDS-PAGE analysis of the expression of His-MLP-2-2 fusion protein and nickel agarose affinity chromatography of the fusion protein

对His-MLP-2-2 单独进行SDS-PAGE 蛋白凝胶电泳，检验蛋白条带浓度及杂蛋白含量。结果（图5-a）发现，纯化蛋白单一性较强，杂蛋白含量较低，蛋白纯化效果较好。

为确定所获得的纯化蛋白为目的蛋白，Western Blot 技术方法，用TMB 显色试剂盒显色。结果如图5-b 所示，在对应位置出现明显目的条带，证明该蛋白为目的蛋白。

图5 His-MLP2-2 纯化蛋白SDS-PAGE 及Western Blot 分析Fig.5 SDS-PAGE analysis and Western Blot analysis of the final purified His-MLP2-2 protein

2.4 MLP2-2 抑制金柑叶片总蛋白降解的效果

MLP2-2 蛋白对金柑叶片总蛋白的降解率检测结果（表1）表明，在0～10 h，对照组和添加MLP2-2蛋白组的降解率差别小，降解率为3.3%～3.7%。至20 h 时，对照组金柑蛋白降解率上升，降解率达6.5%，而添加MLP2-2 蛋白的处理组，其金柑总蛋白降解率基本保持3.4 %左右。至30 h 时，对照组金柑叶片总蛋白降解率大幅上升，达到19.2%，而添加MLP2-2 的处理组的蛋白降解率基本，维持在3.0%左右。说明MLP2-2 具有蛋白酶抑制剂活性，能抑制金柑叶片中总蛋白质的降解。

表1 金柑蛋白提取液在不同时间段内的总蛋白降解率Table 1 Degradation r ate of tot al protein i n e xtraction fr om kumquat leaves at different times

3 结论与讨论

研究表明，植物的抗冻有“耐受”和“避免”2 种机制[13-14]。避免冻害类植物以种子的形式越冬或在组织中积累大量的抗冻物质，种子干燥后无法结冰，从而避免冰冻的危害；耐受冻害类植物既能忍受胞外冰晶的形成，又可避免胞内冰晶的形成，在低于胞外冰晶形成的温度时，耐受冻害类植物才会出现冻害。由于耐受冻害类植物一般会产生抗冻蛋白，可以使冰晶钝化，细胞不会出现严重的破损。前期试验中发现，金柑突然受到冰冻胁迫后，叶片细胞严重失水，大量的细胞出现破损，最后死亡；而经历冷驯化的金柑受到冰冻胁迫后，叶片细胞失水也很严重，大量的细胞出现破损，但将其转移至温室后，叶片细胞得到修复，植株表现出较强的抗冻能力。金柑的抗冻表象有别于已知的2 种抗冻机制，推测在金柑中存在自身修复的抗冻机制。前期的研究也表明，MLP2–2基因在金柑冷驯化过程中会特异性表达。对冷驯化诱导金柑幼苗表达MLP2–2基因并克隆得到该基因，生物信息学研究表明，MLP2–2与豆类Kunitz 蛋白酶抑制剂同源性较高；MLP2-2与胰蛋白酶存在互作。MLP2–2转入大肠杆菌构建工程菌，经大量表达获得目的基因蛋白，经抑制蛋白酶活性研究推测，MLP2-2 是一种Kunitz 蛋白酶抑制剂。双子叶植物中普遍存在Kunitz 蛋白，Kunitz蛋白能够调控蛋白酶的活性, 有效抑制植物内源性蛋白活力，避免蛋白质过度降解, 促进细胞内稳态平衡[7]。本研究中，对金柑蛋白降解率进行检测，发现金柑冷驯化过程中MLP2–2的特异性表达，抑制了金柑叶片细胞内的蛋白酶活性，减缓了细胞内功能蛋白的降解，从而维持了细胞的基本功能，增强了金柑抗冷胁迫能力。至于MLP2-2 蛋白抑制了哪些蛋白酶，保护了哪些蛋白还需要进一步研究。