刘旸 王淼 王丽婷 房玉国＊ 黄晓林 韩超男

（1.黑龙江省绿色食品科学研究院，黑龙江哈尔滨 150028；2.黑龙江飞鹤乳业有限公司，黑龙江哈尔滨 150100）

烟酸和烟酰胺总称为维生素PP，是人体中必需的13种维生素之一。无论是人体还是动物体，烟酸都能转化为具有生物活性的烟酰胺，烟酰胺是辅酶Ⅰ、辅酶Ⅱ的组成部分[1-4]。这两种辅酶是人体代谢正常氧化还原反应中具有关键作用的酶[5-8]。在婴幼儿配方食品中添加烟酸和烟酰胺，对婴幼儿的皮肤、消化和神经系统的生长和正常发育都十分重要[9-13]。现行检验烟酸和烟酰胺的标准是GB 5009.89-2016《食品中烟酸和烟酰胺的测定》[14]，主要采用高效液相色谱法和微生物法进行测定。根据GB/T 27418-2017《测量不确定度评定和表示》[15]，只要有检验检测过程就会有测量系统误差[16-19]，这就在烟酸和烟酰胺的测定过程中有不确定度的产生，为了让测定的结果准确就要引入测量不确定度。本文主要对微生物法测定婴幼儿配方粉中烟酸和烟酰胺的测量不确定度进行评定[20-24]。根据JJF 1059.1-2012《测量不确定度评定与表示》[25]与CNASCL01-G003-2019《测量不确定度的要求》[26]，确定微生物法测定婴幼儿配方粉中烟酸和烟酰胺的测量不确定度的来源，作为检验检测实验室，减小测量误差、保证出具的数据评定报告具有准确性和有效性，是一个实验室的必备要求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

氯化钠，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；无水乙醇，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；硫酸（98%），分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；氢氧化钠，分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司；烟酸（C6H5NO2，CAS 号：59-67-6；纯度≥98%）或烟酰胺（C6H6N2O，CAS 号：98-92-0；纯度≥98%），西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；乳酸杆菌琼脂培养基，美国BD Difco；乳酸杆菌肉汤培养基，美国BD Difco；烟酸测定用培养基，美国BD Difco。

1.2 仪器与设备

恒温培养箱，德国MMM；722 分光光度计，上海光谱仪器；电子分析天平，北京赛多利斯；pH 计，北京赛多利斯；盖勃离心机；破壁料理机，美国Westinghouse。

1.3 实验方法[14]

1.3.1 菌悬液的制备

将实验用植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum,ATCC 8014）菌株活化后，接种到乳酸杆菌琼脂培养基上，36℃±1℃培养16 h～24 h，再转种2 代-3 代来增强活力。将24 h 内活化后的菌株接种到乳酸杆菌肉汤培养基中，36℃±1℃培养16 h～24 h，以大于3000 转/ 分钟离心5 min，弃去上清液，加入10 mL 生理盐水，用涡旋混合器振荡该悬液。再离心5 min，弃去上清液。如前操作清洗2 次～3次后，再加10 mL 生理盐水，混匀。吸取适量该菌悬液于10 mL 生理盐水中，混匀制成测试菌悬液。以生理盐水做空白，用分光光度计于550 nm 波长下测定测试菌悬液透光率T（%），调整上述菌液加入量，使测试菌悬液透光率在60%～80%。

1.3.2 测定用样品及制备和保存

1.3.2.1 测定用样品信息

婴幼儿配方粉（中国检验检疫科学研究院测试评价中心的质控样品，证书编号为803IP04051，Lot 2017.09.19，烟酸标示值范围为4824 μg/100 g～5595 μg/100 g）。

1.3.2.2 测定用样品制备和保存

婴幼儿配方粉每个包装冷冻到-20℃存放，使用前恢复至室温。

1.3.3 样品的前处理

准确称取2 g～3 g（精确至0.0001 g）试样于锥形瓶中，加入50 mL、0.5 mol/L 硫酸溶液，121℃水解30 min，取出迅速水浴冷却至室温。用氢氧化钠调节pH 至4.5±0.2，移入250 mL 容量瓶中用水定容至刻度。用定量滤纸过滤，最初约10 mL 滤液应弃去，吸取1 mL 滤液于100 mL 烧杯中，加水约20 mL，用氢氧化钠溶液调节pH 至6.8±0.2，移入100 mL 容量瓶中加水定容至刻度。

1.3.4 标准品的制备

1.3.4.1 烟酸（或烟酰胺）标准储备液（100 μg/mL）

在含五氧化二磷的干燥器中取出干燥后的烟酸（或烟酰胺）标准品，称取50.0 mg（精确至0.1 mg），用乙醇溶液（25%）溶解并定容至500 mL。

1.3.4.2 烟酸（或烟酰胺）标准中间液（50 μg/mL）

吸取50 mL 烟酸（或烟酰胺）标准储备液（100 μg/mL）至100 mL 容量瓶，用乙醇溶液（25%）定容。

1.3.4.3 烟酸（或烟酰胺）标准使用液（500 ng/mL）

吸取1.0 mL 烟酸（或烟酰胺）标准中间液（50 μg/mL）至100 mL 容量瓶，用水定容至刻度。

1.3.4.4 烟酸（或烟酰胺）标准曲线工作液

分两个浓度，高浓度溶液的浓度为10 ng/mL；低浓度溶液的浓度为5 ng/mL。从使用液中（500 ng/mL）吸取两次各5 mL，用水分别定容到250 mL 和500 mL。

1.3.5 微生物法测定烟酸和烟酰胺含量的计算公式

式（1）中：X-样品中烟酸和烟酰胺含量，单位为微克每百克（μg/100 g）或微克每百毫升（μg/100 mL）；ρ-计算得到的试样处理液中烟酸和烟酰胺含量的总平均值，单位为纳克（ng）；f-稀释倍数；m-试样的质量或体积，单位为克（g）或毫升（mL）。

2 微生物法测定婴幼儿配方粉中烟酸和烟酰胺不确定度的评定

2.1 标准物质P 的测量不确定度[27-28]

经过验证，微生物法在测定烟酸和烟酰胺时，烟酸和烟酰胺具有相同的生物活性，所以只要采用一种标准物质进行烟酸和烟酰胺的测定即可。这里采用烟酸作为标准品，烟酸标准物质的纯度P ≥98%（g/g），扩展不确定度U=0.49%（g/g），相当于：烟酸的纯度P=0.98（g/g），扩展不确定度U=0.0049（g/g），由于标准证书上没有相关不确定度的其他信息，故假设是矩形均匀分布，烟酸标准物质的标准不确定度u(P)=0.0049/=0.002829。烟酸标准物质的相对不确定度urel(P)=u(P)/0.98=0.002887。

2.2 样品称量m 的测量不确定度[29-30]

称取婴幼儿配方粉样品7 次，选取5 ng/mL 浓度水平进行重复性实验，在相同的条件下测定样品中的烟酸，如表1所示。

表1 微生物法测定婴幼儿配方粉中烟酸的结果

分析天平称量的三个不确定度来源：重复性、可读性（数字分辨力）和由于天平校准产生的不确定度分量。天平的灵敏度及其线性：因为称量范围很窄，忽略其对不确定度的贡献。

样品称量过程中，样品的质量m的不确定度受天平最大允许差和天平的分辨力影响。利用校准证书的数据和制造商关于不确定度评定的建议，对标准品称量有关的不确定度进行估算，结果为±0.1 mg，这种评定考虑了前面已识别的3种分量。即标准不确定度u(m)=0.0001/=0.00005774。样品称量质量m的相对不确定度为urel(m)=u(m)/m=0.00005774/2.5565=0.00002259。

2.3 稀释倍数f 的测量不确定度

根据GB/T 27418-2017《测量不确定度评定和表示》[15]可知，测量不确定度是利用可获得的信息，表征赋予被测量量值分散性的非负参数。测量不确定度一般由若干分量组成。其中一些分量可根据一系列测量值的统计分布，按照测量不确定度的A 类进行评定，并可用标准差表征。而另一些分量测量可根据经验或其他信息所获得的概率密度函数，按照测量不确定度的B 类进行评定，也用标准差表征。A 类评定是对在规定测量条件下测得的量值用统计分析的方法进行的测量不确定度分量的评定。B 类评定主要基于权威机构发布的量值、有证参考物质的量值、校准证书、仪器的漂移、经检定的测量仪器的准确度等级和根据人员经验推断的极限值等。其中电子分析天平的校准证书就是B 类评定的主要依据。

根据JJG 196-2006《常用玻璃仪器检定规程》[31]，在标准品配制和样品稀释过程中涉及的玻璃器皿为100 mL、250 mL和500 mL单刻度容量瓶，1 mL、5 mL和50 mL单刻度移液管。在实验过程中所使用的天波牌玻璃器皿都是A 级玻璃器皿，并且在20℃时都已经校准，并且都取矩形均匀分布[31]，则包含因子为k=。20℃时水的膨胀系数α=0.00021℃-1，实验室温度变化为Δt±4℃，按矩形均匀分布，包含因子k=。玻璃器皿在测定过程中，不仅要考虑玻璃器皿内部体积的测量不确定度，还要考虑溶液温度和玻璃器皿与校准温度引起的不确定度，按矩形均匀分布。各玻璃器皿对标准品的配制和样品稀释的影响，如表2 所示。

表2 各玻璃器皿对标准品和样品稀释的影响

由表2 可知，玻璃器皿对标准品配制过程中产生的相对不确定度为：

玻璃器皿对样品稀释过程中产生的相对不确定度为：

2.4 试样处理液中烟酸含量ρ 的重复性的测量不确定度

2.5 测量不确定度的合成与评定

2.5.1 标准物质P 的测量不确定度的评定

根据2.1 节和表2 可知，标准物质的不确定度是配制过程中标准物质证书上的不确定度以及逐步稀释配制过程中玻璃器皿等产生的。由于微生物法测定的烟酸的标准曲线符合ATCC 8014 植物乳杆菌的生长曲线，并不呈现线性，所以不考虑标准曲线的不确定度的影响。即标准物质P 相对不确定度U(P)=(urel2(P)+urel2(P 玻璃器皿))1/2=0.005021。

2.5.2 样品称量m 的不确定度的评定

根据2.2 节和表1 可知，样品称量m 的不确定度是样品重复性称量和分析天平自身产生的。即样品称量m 的相对不确定度

2.5.3 稀释倍数f 的不确定度的评定

根据2.3 节和表2 可知，样品的稀释倍数为25000 倍，稀释过程中产生的不确定度受玻璃器皿和温度的影响，其中温度的影响已经包含在玻璃器皿的测量不确定度里。即稀释倍数f的相对不确定度为U(f)=urel(f 玻璃器皿)=0.01145。

2.5.4 试样处理液中烟酸含量ρ 的重复性的不确定度的评定

根据2.4 节和表1 可知，试样处理液中烟酸含量ρ 的重复性相对不确定度为U(ρ)/5.3127=0.001134。

2.5.5 微生物法测定婴幼儿配方粉中烟酸和烟酰胺的测量不确定度的评定

根据3.1 节～3.4 节可知，微生物法测定婴幼儿配方粉中烟酸和烟酰胺的测量不确定度为：U(X)=(U(P)2+U(m)2+U(f)2+U(ρ)2)1/2=0.01272 ≈0.01。

2.5.6 扩展不确定度的计算根据测量不确定度评定指南对一般检验检测实验室的要求[16]，包含因子一般取k=2。因此，微生物法测定婴幼儿配方粉中烟酸和烟酰胺的相对扩展不确定度Urel=k×U(X)=2×0.01=0.02 。由表1 可知，微生物法测定婴幼儿配方粉中烟酸的含量为5209.04 μg/100 g，则扩展不确定度U=5209.04×0.02=104.18 μg/100 g ≈100 μg/100 g，k=2。

3 结论

采用微生物法测定婴幼儿配方粉中烟酸和烟酰胺时，当称样量为2 g～3 g（精确至 0.0001 g）、试样处理液中烟酸含量ρ 为5.0 ng±0.5 ng 时，扩展不确定度为U=100 μg/100 g，k=2。当采用微生物法测定婴幼儿配方粉中烟酰胺时，只需在测定烟酸的基础上乘以一个系数1.008，即可转化为烟酸的结果。其测量不确定度的评定过程和烟酸一致。在实验过程中，影响微生物法测定婴幼儿配方粉中烟酸和烟酰胺的主要因素是样品的稀释过程，标准品的配制、样品称量过程以及试样中烟酸和烟酰胺含量的重复性的影响较小。其中样品称量过程以及试样中烟酸和烟酰胺的含量的重复性为测量不确定度A 类评定，样品的稀释过程和标准品的配制为测量不确定度B 类评定。样品的稀释过程对测量不确定度的影响较大原因分析为稀释倍数大，采用的玻璃器皿较多，在使用过程中，人员在操作规范的同时，要注意实验环境如温度、水的膨胀系数等对实验过程的影响，避免误差过大，提高准确度。