赵毅杰， 苏俭生

（上海牙组织修复与再生工程技术研究中心，同济大学口腔医学院，同济大学附属口腔医院口腔修复科，上海 200072）

口腔和头颈部癌症的治疗方法通常为手术结合放疗或化疗[1]。 手术切除口腔肿瘤往往会造成口腔内缺损， 严重影响患者的口腔功能及生活质量[2]。因钛作为非铁磁性材料具有良好的生物相容性、耐腐蚀性[3]，有足够的强度能够保持面部轮廓稳定的结构， 使其在颌面部手术重建中得到广泛应用，成为了一种良好的假体基础材料。 但纯钛由于其生物惰性，不利于其与肌肉组织之间形成快速结合，导致术后假体附着的肌肉生长不良， 造成肌肉萎缩，致使患者预后不良，影响了局部的美观和功能[2]。 与传统钛假体表面相比，具有微观结构的表面能够促进细胞的增殖、分化和黏附。 细胞外基质在纳米尺度上刺激细胞并与之相互作用。 为了能够形成更多的微米甚至纳米级别的表面形态， 相关研究应用喷砂、化学、物理改性处理及TiO2纳米管阵列等方式来更好地促进细胞黏附和增殖[4-7]。

学者研究发现，阳极氧化钛衬底上的TiO2纳米管表面具有良好的边界和结构坚固的形貌，在阳极氧化过程中，通过改变电压和电解液可以获得不同的孔径和高度[8-10]。 Oh 等[11]发现TiO2纳米管对成骨作用具有良好的效果，但目前TiO2纳米管对成肌的效果却鲜有报道。 本研究选择了10、15、20 V 3 种电压，通过阳极氧化方法形成不同管径的TiO2纳米管，观察其对C2C12 成肌细胞的伸展、增殖及分化的影响，以筛选出最适管径的TiO2纳米管。

1 材料和方法

1.1 纯钛片预处理

取圆型TA2 纯钛片（Φ14 mm，厚1 mm；宝鸡钛业股份有限公司，中国），用碳化硅砂纸逐级将其抛光至1000 目，随后依次用丙酮、无水乙醇和去离子水清洗15 min，干燥，用高压蒸汽机灭菌后备用，用PT（pure titanium）标示。

1.2 TiO2 纳米管制备

室温环境下，以钛片作为阳极、铂片作为阴极，在0.1%HF（hydrofluoric acid；国药集团化学试剂有限公司，中国）电解液中，分别将电压调至10、15 和20 V， 反应20 min， 反应后的3 组样品分别用TNT10、TNT15 和TNT20 标示， 用无水乙醇和去离子水分别清洗20 s， 用高压蒸汽机灭菌后备用，并用扫描电镜（SEM）（型号：SU8010；Hitachi 公司，日本）测得最后管径。

1.3 细胞培养

用含10%胎牛血清（fetal bovine serum， FBS）和1%青、链霉素的高糖DMEM 培养基（Hyclone 公司，美国）培养小鼠C2C12 成肌细胞株（武汉普诺赛生命科技有限公司，中国），将其放置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养，当细胞汇合至80%时进行传代，取第3 代细胞用于后续实验。

1.4 细胞形态

将样品放置于细胞接种同细胞增殖，细胞培养24 h 后， 每组任选3 个样品， 磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS） 清洗3 遍后用2.5%戊二醛固定，将其置于4 ℃的冰箱中2 h，用PBS 洗涤3 次，分别用30%、50%、70%、85%、90%的乙醇梯度脱水各1 次，用100%乙醇脱水3 次，每次10 min，用临界点干燥法干燥后喷金，用SEM 观察细胞形态。

1.5 细胞增殖

将各组样本经过钴60（25 kGy）辐照法消毒后，放入24 孔板内， 每组设置3 个平行孔。 将培养的C2C12 成肌细胞按照5×103个/孔的密度分别接种于样本表面。将C2C12 成肌细胞培养至1、3、5、7 d 4 个时间点， 在每个时间点时使用CCK-8 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，中国）检测，到达相应的时间点后，吸出培养基，加入500 μL 普通培养基，随后加入50 μL 的CCK-8 溶液，将其避光放入培养箱反应2 h。 随后吸出100 μL 培养液放入96 孔板内，重复3 次，全程避光。最后应用酶标仪测定波长为450 nm 处的吸光度值。

1.6 实时荧光定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析

C2C12 成肌细胞接种3、7 d 后， 用TRIzol（TaKaRa Bio Inc 公司，日本）法提取细胞总RNA，利用逆转录试剂盒（TaKaRa Bio Inc 公司，日本）逆转录获得cDNA。 随后，通过罗氏Light Cycler480 检测仪检测Myh3、Myod1、Myog 的基因表达水平（表1）。

表1 基因引物序列Table 1 Primer sequences

1.7 统计学分析

本实验数据采用SPSS 20.0 和GraphPad Prism 8.4 软件进行统计学分析，每组实验重复3 次。 2 组之间采用t检验进行分析，对2 组及以上的比较进行单因素方差分析，若P＜0.05 认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同管径TiO2 纳米管表征结果

SEM 结果（图1）显示，纯钛片经过抛光后可见抛光划痕，但无特殊的形貌结构。 经过不同电压下阳极氧化处理后的TiO2纳米管显示出了均匀的管状纳米结构，各管壁独立，管间无明显界限。 随着电压的增大，TNT 组管径也随之增大。阳极氧化10、15、20 V 电压对应的管径分别为25、50、100 nm。

图1 各组样品的SEM 表面形貌Figure 1 SEM images of the surface morphology of TiO2 samples in different groups

2.2 C2C12 成肌细胞增殖结果

CCK-8 检测结果（图2） 可直接反映5 d 和7 d时，TNT 各组的吸光度值均高于PT 组，表明这种纳米管结构更有利于细胞的生长和增殖。 此外，TNT组间的吸光度值也不同，说明不同管径的纳米管对细胞的影响也不同。TNT15 组对于C2C12 细胞增殖的效果最佳， 与PT 组具有显著差异 （P＜0.01）。TNT20 组相较于TNT15 组，细胞增殖的数量有了明显的下降趋势（P＜0.01）。

图2 C2C12 成肌细胞在不同组表面培养1、3、5、7 d 的CCK-8结果Figure 2 CCK-8 results of C2C12 myoblasts cultured on the surfaces of different groups for 1, 3, 5 and 7 days

2.3 C2C12 成肌细胞形态

SEM 结果（图3）显示，24 h 铺板后，每组样品的C2C12 成肌细胞均成功黏附，PT 组C2C12 成肌细胞铺展不明显。由于TiO2纳米管增加了表面粗糙度，增加了亲水性，展现出对于细胞更好的黏附效果， 所以TNT15 组和TNT20 组伸展出更多的伪足和伪板。

图3 C2C12 成肌细胞在各组样品表面培养24 h 后的细胞形态（×500）Figure 3 Morphology of C2C12 myoblasts cultured on the surfaces of differnet groups after 24 hours（×500）

2.4 成肌基因表达的检测

Myog、Myh3 和Myod1 这3 个基因是调节成肌分化的重要基因。在细胞铺板3 d（图4A—C）和7 d（图4D—F）后，TNT 各组中，除TNT20 组在7 d 时，其余各组在3 个基因中的表达高于PT 组， 其中TNT15 组的表达显著高于其他组。 在培养3 d 时，TNT20 组Myog 和Myh3 这2 个基因的分化表达高于TNT10 组；TNT10 组 中，Myod1 的 表 达 高 于TNT20 组。 在培养7 d 时，当管径小于50 nm 时，随着管径的增大，促进了成肌的分化，这与之前的增殖结果相一致，而TNT20 组展现出了对成肌分化的相对抑制作用， 在TNT10 组中，3 个基因的表达均高于TNT20 组。 小孔径TiO2纳米管这样的表面拓扑结构，其良好的亲水性能增加细胞的前期黏附作用，转化为机械信号，促进了细胞的增殖和分化。

图4 C2C12 成肌细胞在不同样品表面培养3、7 d 后，Myog、Myh3、Myod1 基因检测水平结果Figure 4 Gene expression levels of Myog, Myh3 and Myod1 in the C2C12 myoblasts cultured on different samples for 3 and 7 days

3 讨论

在口腔颌面部整复手术中，以钛为基础材料的假体应用十分广泛。 在支撑起面部轮廓的同时，手术后形成肌肉萎缩的问题依然没有得到解决[2]。 随着近年来生物材料学的不断发展，材料表面的改性得到了越来越多的关注。

细胞外基质具有纳米级的复杂特征，它能在纳米尺度上刺激细胞并与之相互作用[12]。有学者的研究显示， 人造的纳米结构能够起到类似细胞外基质的作用，影响细胞的生理学，人造的纳米结构能够影响细胞的黏附、增殖和分化[13-15]，这样的制造技术已经能够精确控制人造表面上的纳米结构。Wu 等[12]利用阳极氧化的技术在钛表面形成纳米管结构，并将该技术用在骨再生实验中，以促进骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）的增殖和分化。 TiO2纳米管表面具有良好的边界和坚固的表面形态，能够自组装、高度有序而且垂直排列。 喷砂、化学蚀刻等表面改性的方法相比较于TiO2纳米管，不能够产生宏观和微观上的均匀性[14]。

因此，我们选择了TiO2纳米管这种表面改性的方式，在体外研究其不同孔径对于C2C12 小鼠成肌细胞的生理性影响， 并筛选出一个最佳管径促进C2C12 细胞的增殖分化。 通过SEM 图像显示纳米管， 系统展现了这类纳米拓扑结构具有更清晰、可重复和可靠性更高的粗糙度。 基于阳极氧化形成纳米管的机制，我们通过改变电压的强度，形成了不同管径的纳米管，随着电压的增大，管径也随之增加。纳米管系统具有良好的亲水性[16]，能够促进细胞在其表面的黏附，本研究展现出了同样的结果。 各TiO2纳米管组均有效促进了细胞的伪板和伪足的产生。 Wang 等[17]的研究显示，随着纳米管管径的增大，成骨的生化活性也随之增大。 在细胞水平上，细胞整合素和纳米管表面黏附点的横向距离有关，孔径的增大改变了跨膜整合素的位置和间距[18]。 黏附细胞的力通过整合素向细胞骨架传递，所以我们发现在TNT15 和TNT20 这2 组中，细胞的黏附更好。研究表明， 15～30 nm 的管径为BMSCs 整合素聚集的最佳距离[19-20]，当管径达到100 nm 时会发生细胞凋亡。 在成肌细胞实验中，本研究发现，当管径为50 nm 时，成肌细胞的增殖与分化最好；当管径达到100 nm 时，增殖与分化的效果反而下降，与成骨研究实验结果相类似[13-19]。

综上，50 nm 管径的TiO2纳米管能更好地促进小鼠C2C12 细胞的增殖、黏附、铺展和分化，这部分的细胞学实验也为今后体内研究打下了基础，并为未来口腔颌面部肌肉组织工程学提供了相关实验依据。