赵丹

摘 要：目的：建立一種利用高效液相色谱-串联质谱仪的方法，测定养殖鱼中孔雀石绿（Malachite Green，MG）、结晶紫（Crystal Violet，CV）、隐色孔雀石绿（Leuco Malachite Green，LMG）及隐色结晶紫（Leuco Crystal Violet，LCV）残留量，为了解辖区市售水产品中禁用兽药残留情况，为食品安全风险评估提供可靠依据。方法：本方法依据《2017年国家食品污染和有害因素风险监测工作手册》监测方法，样本经乙腈提取，中性氧化铝固相萃取小柱净化，液相色谱分离后进入质谱仪，以电喷雾正离子化模式（ESI+）和多反应检测（Multi Reaction Detection，MRM）扫描模式测定，同位素内标法定量。结果：养殖鱼中孔雀石绿（MG）、结晶紫（CV）及其代谢物共4种成分在0.25～10.00 ng/mL线性关系良好，相关系数r均大于0.998，检出限均为0.5 μg/kg，在0.5～2.0 μg/kg加标回收率在83.8%～109.7%。对40份养殖鱼（大菱鲆、乌鳢和鳜鱼）进行检测，其中2份隐色孔雀石绿（LMG）有检出，检出率为5%，其他成分无检出。结论：该方法简单快速、定量准确、灵敏度高，可用于养殖鱼中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物残留定量测定。

关键词：养殖鱼;孔雀石绿（MG）;结晶紫（CV）;液-质联用（LC-MS）

Simultaneous Determination of Malachite Green， Crystal Violet and Their Metabolite Residues in Cultured Fish by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

ZHAO Dan

（Xigang District Center for Disease Control and Prevention， Dalian 116014， China）

Abstract： Objective： To establish a method for the simultaneous determination of malachite green （MG）， crystal violet （CV）， leuco malachite green （LMG） and leuco crystal violet （LCV） residues in cultured fish using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometer method. To understand the banned veterinary drug residues in aquatic products sold in the jurisdiction and provide a reliable basis for food safety risk assessment.Method： According to “2017 National Food Pollution and Harmful Factor Risk Monitoring Work Manual”，samples were extracted with acetonitrile， purified by neutral alumina solid phase extraction cartridge， separated by liquid chromatography， and then entered into the mass spectrometer，determined by electrospray positive ionization mode （ESI +） and multireaction detection （MRM） scanning mode， and isotope internal standard method Quantitative.Conclusion： The four components of malachite green （MG）， crystal violet （CV） and their metabolites in cultured fish have a good linear relationship within the concentration range of 0.25～10.00 ng/mL， the correlation coefficient r is greater than 0.998， and the detection limit is 0.5 μg/kg， the recovery rate of standard addition within 0.5～2.0 μg/kg is between 83.8%～109.7%.Forty cultured fish （turbiny turbot， black snakehead and mandarin fish） were tested， of which 2 leuco malachite green （LMG） were detected， with a detection rate of 5%， and no other ingredients were detected. Conclusion： The method is simple， fast， accurate and sensitive， and can be used for the quantitative determination of malachite green， crystal violet and their metabolite residues in cultured fish.

Keywords： cultured fish; malachite green （MG）; crystal violet （CV）; liquid chromatography-mass spectrometry （LC-MS）

孔雀石绿（Malachite Green，MG）又名苯胺绿，结晶紫（Crystal Violet，CV）又名甲紫，二者皆属三苯甲烷类染料、杀菌杀虫制剂。进入水生动物体后会快速代谢成脂溶性的隐色孔雀石绿（Leuco Malachite Green，LMG）及隐色结晶紫（Leuco Crystal Violet ，LCV），已證实二者及其代谢物皆有致癌、致畸、致突变毒副作用[1-2]，对人体有积蓄危害，目前已被多国列为禁用药物[3-4]，也是我国重点打击的禁用兽药[1-4]。我国早在2002年就将孔雀石绿列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》[5]，禁止用于食品动物。然而结晶紫曾用于防治鱼类霉鳃病，孔雀石绿针对鱼体鱼卵真菌水霉病有特效，也可治疗其他多种细菌性疾病。在运输过程中，鱼贩也常用孔雀石绿为鳞皮受损的鱼延长生命，市面又尚无低廉有效的替代品，这是水产业养殖户继续违规使用孔雀石绿的根本原因，致使其在水产养殖中多年屡禁不止。

目前常用来检测孔雀石绿、结晶紫及其代谢物的方法主要有酶联免疫法、分光光度法、高效液相色谱法、液-质联用法等，其中液-质联用技术灵敏度较高，应用最为广泛[2]。本实验采用中性氧化铝固相萃取结合液-质联用技术快速检测养殖鱼中孔雀石绿、结晶紫、隐色孔雀石绿及隐色结晶紫残留量，旨在为有效预防和控制禁用兽药残留带来的潜在危害，提供有效检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

1.1.1 样本来源

养殖鱼（大菱鲆、乌鳢和鳜鱼），样本采集点覆盖市内4区（中山区、西岗区、沙河口区和甘井子区）多家商超、零售、集市和农贸市场，样本来源地主要集中在市内4区及北三市。

1.1.2 仪器

LC-20AD高效液相色谱仪（日本岛津公司）;API 3200三重四级杆串联质谱仪（美国AB SCIEX公司，具有ESI+电离源）;XS205DV十万分之一电子天平、ME104E/02万分之一电子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）;Vortex genie2型涡旋振荡器（美国Scientific Industries公司）;KQ-500DE型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）;Z 32HK型高速离心机（德国HERMLE公司）;VACElut SPS 24固相萃取装置（安捷伦科技有限公司）;DCY-24S氮吹仪（青岛海科仪器有限公司）;PURELAB Classic UVF纯水仪（英国ELGA LABWATER公司）;微孔滤膜（13 mm 0.22 μm GHP，美国Waters公司）;中性氧化铝固相萃取柱（6 mL/g，美国Waters公司）。

1.1.3 试剂及配制

甲酸（色谱纯，浓度≥99.0%，北京迪科马科技有限公司）;乙腈（色谱纯，浓度≥99.9%）;乙酸铵（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司）;孔雀石绿（纯度95.8%，德国Dr.Ehrenstorfer公司）;隐色孔雀石绿（纯度99.0%，德国Dr.Ehrenstorfer公司）;结晶紫、隐色结晶紫（浓度100 μg/mL，北京坛墨质检科技有限公司）;孔雀石绿D5（纯度99.7%，德国WITEGA公司）;隐色孔雀石绿D6（纯度99.8%，德国WITEGA公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液及同位素内标溶液配制

分别准确称取孔雀石绿（MG）、隐色孔雀石绿（LMG）、孔雀石绿D5（MG-D5）及隐色孔雀石绿D6（LMG-D6）标准物质（10±0.1）mg，用少量乙腈溶解，并转移至10 mL容量瓶中乙腈定容，配制成

1 000.0 μg/mL标准储备液，于-18 ℃保存;结晶紫（CV）、隐色结晶紫（LCV）标准储备液浓度为100 μg/mL。

用乙腈分别将4种标准储备液及2种同位素内标储备液稀释成10.0 μg/mL标准中间液，于4 ℃保存。分别取4种标准中间液各100 μL，用乙腈定容至

10 mL并混匀，制成混合标准工作液，4 ℃保存;再取500 μL孔雀石绿D5同位素内标储备液及100 μL隐色孔雀石绿D6同位素内标储备液，用乙腈定容至

10 mL并混匀，制成混合同位素内标工作液，4 ℃保存。

1.2.2 标准曲线配制

取100 ng/mL混合标准工作液和混合同位素内标工作液，用起始流动相溶液配制成0 ng/mL、

0.25 ng/mL、0.50 ng/mL、1.00 ng/mL、2.50 ng/mL、

5.00 ng/mL和10.00 ng/mL浓度系列，内标含量孔雀石绿D5为5.00 ng/mL、隐色孔雀石绿D6为1.0 ng/mL。

1.2.3 流动相配制

准确称取0.079 g乙酸铵，加水溶解并定容至200 mL容量瓶中，加入200 μL甲酸，混匀，超声脱气后使用。

1.2.4 样本制备

取具有代表性的鱼肉样本可食部分约500 g，捣碎混匀装入自封袋密封标记好，-18 ℃保存备用。

1.2.5 样本提取

称取5 g（精确至0.1 g）均匀样本于50 mL塑料离心管中，加50.0 μL混合同位素内标工作液，加入

25 mL乙腈并涡旋振荡混匀，8 000 r/min离心10 min，收集上清液于塑料离心管中待净化。

1.2.6 样本净化

先用5 mL乙腈活化中性氧化铝固相萃取小柱，再取5 mL离心上清液加入小柱并收集滤液，用

4 mL乙腈淋洗小柱并收集滤液，将上述混合滤液于50 ℃以下氮吹近干，用1 mL起始流动相溶解残渣，过0.22 μm滤膜后收集于进样瓶中，待上液质联用仪检测。

1.2.7 样本测定

（1）色谱条件。色谱柱为Agilent，ZORBAX SB-C18，2.1 mm×100 mm，3.5 μm;流动性及梯度：流动相A为乙腈，流动相B为5 mmol/L乙酸铵-0.1%甲酸水溶液;柱温：40 ℃，进样量10 μL，液相色谱梯度洗脱程序见表1。

（2）质谱条件。电离方式ESI+，监测模式MRM，离子源温度350 ℃，离子喷雾电压5 500 V，各组分定性定量离子对及DP和CE值，见表2。

2 结果与分析

2.1 数据分析

使用AB SCIEX API 3200液-质联用仪专用数据处理软件analyst software1.6处理检测原始数据，利用Microsoft Excel 2010录入并整理，WPS Office（11.1.0.10304）制作表格統计分析。

2.2 仪器条件优化

先将各组分配制成500 ng/mL溶液，利用针泵进样，找到母离子和子离子以确定MRM离子对，优化各DP和CE值，见表2。确定最优质谱检测条件后进一步优化液相色谱分离条件，找到最优分离梯度，见表1，并确定内标添加量孔雀石绿D5为5.0 ng/mL、隐色孔雀石绿D6为1.0 ng/mL，进行测定。

2.3 标准曲线及检出限

以各目标物测定浓度为横坐标，目标物与对应同位素内标峰面积比为纵坐标，绘制各组分标准曲线，在0.25～10.00 ng/mL线性关系良好，r均大于0.998，检出限均为0.5 μg/kg，线性回归方程见表3。

2.4 回收率实验

分别向空白样本中添加混合标准工作液、混合同位素内标工作液，按照1.2.5至1.2.7步骤处理并检测。加标浓度为0.5 μg/kg、1.0 μg/kg、2.0 μg/kg 3个水平，每浓度6份平行样本，检测结果见表4，4种成分回收率在83.8%～109.7%，相对标准偏差在3.1%～7.7%，满足检测要求。

2.5 样本测定

利用本法对当年采集的40份养殖鱼进行检测，其中有1份大菱鲆及1份乌鳢LMG有检出，检出率为5%（2/40），其他成分均未检出。

3 结论

本法利用乙腈提取，中性氧化铝固相萃取结合液-质联用技术，实现对养殖鱼中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物的快速定量检测，方法前处理过程简单，分析时间短、定量准确、灵敏度高，可满足后续检测的需要。

参考文献

[1]刘名扬，肖珊珊，于兵，等.水产品中孔雀石绿和结晶紫残留检测技术的研究进展[J].食品安全质量检测学报，2015，6（1）：35-40.

[2]华正罡，冯静，伊萍，等.超高效液相色谱-串联质谱法测定淡水鱼中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物残留[J].中国卫生检验杂志，2014，24（22）：3238-3240.

[3]杨盈悦，朱羽庄，梅光明，等.渔业养殖水体中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物残留量的检测方法研究[J].浙江大学学报（理学版），2021，48（4）：461-469.

[4]吴学立，吴永宁，赵云峰，等.液相色谱-线性离子阱质谱法检测草鱼中孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物[J].中国食品卫生杂志，2007（3）：209-214.

[5]中华人民共和国农业农村部.中华人民共和国农业部公告第235号[EB/OL].（2002-12-24）[2021-11-06].http：//www.moa.gov.cn/gk/tzgg_1/gg/201006/t20100606_1535491.htm.