钱希逸，李慧，徐亚飞，杨彩梅，2*

（1.浙江万方生物科技有限公司，浙江 安吉 313307；2.浙江农林大学动物科技学院动物医学院，浙江 杭州 311300）

南美白对虾于20世纪80年代末引进我国，90年代初期进入养殖高峰。基于人工育苗和养殖技术的突破，对虾养殖向规模化、集约化方向发展，但也造成养殖环境恶化与病害频发，对虾成活率过低。养殖者将抗生素当作对虾病害防治的“超级守门员”，然而抗生素的大量使用带来了细菌耐药性、药物残留、水环境污染等问题，最终造成恶性循环。因此寻找环境友好、绿色安全的替抗添加剂成为当前水产营养研究的热点。

目前，有机酸及有机酸盐因易吸收、无毒害和无残留等优点受到关注。丁酸可为结肠上皮细胞提供能量，利于促进细胞分化与维持结肠上皮完整性，提高动物生产性能。丁酸钠是丁酸的主要提供方式。田莉对草鱼投喂含丁酸钠的饲粮，发现丁酸钠能够促进肠道发育，优化肠道菌群结构，增强草鱼对肠炎、赤皮病和烂鳃病的抵抗能力，提高草鱼生产性能。刘文舒等发现包膜丁酸钠能促进肠黏膜修复，增加微绒毛高度和密度等，促进建鲤生长。

植物精油由于其资源丰富、安全、无毒等优点，成为替代抗生素的热门选择，可作为免疫和生理反应调节剂，具有抗应激、抗氧化、促进胃肠道健康的优点。在探究百里香酚对大肠杆菌、沙门氏菌、绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌的体外抑菌效果的试验中发现，百里香酚可导致细胞膜破裂，使胞内物质泄漏，进而杀灭病原菌，有效抑制病原菌生长。王猛强等发现，在饲料中添加植物精油能有效改善南美白对虾的生长性能，促进肠道健康。Zhou等报道，乙酸和柠檬酸等有机酸、香芹酚和百里香酚对伤寒沙门氏菌具有协同抑菌作用，韩乾杰等研究表明，丁酸钠与植物精油存在协同作用，并且能够减少75%复合植物精油的使用。

当前，对丁酸钠和植物精油的研究大多是对单一特性进行分析，对丁酸钠与植物精油协同作用方面的研究相对较少，并且多集中于畜禽养殖，关于甲壳类动物的应用研究较少。本试验以南美白对虾为试验对象，研究丁酸钠植物精油复合制剂对甲壳类动物生长性能、肠道微生物及非特异性免疫的影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验选用健康南美白对虾虾苗500尾。丁酸钠植物精油复合制剂组成为40%丁酸钠+7.5%肉桂醛+2.5%百里香酚，采用独特的固体分散、缓释微囊工艺。该制剂由浙江万方生物科技有限公司提供。

1.2 试验设计

1.2.1 试验饲料配制

试验分为2组，对照组饲喂基础日粮，试验组饲喂基础日粮并添加2.5 kg/t丁酸钠复合植物精油制剂。南美白对虾基础日粮配方及营养水平见表1和2。

表1 南美白对虾基础日粮配方含量 %

表2 南美白对虾基础日粮营养成分 %

1.2.2 试验分组

正式试验前先将虾苗暂养于室外水泥池中，待虾苗长至试验规格后，将其转入室内养殖水桶（4 m），驯化2周以适应试验条件。暂养期间根据虾苗规格投喂饲料，试验分组前24 h停止喂食。选取体质健壮、规格基本一致、平均体长为（4.13±0.05）cm、平均体质量为（1.08±0.05）g的南美白对虾300尾，随机分为2组，每组设3个重复，每个重复50尾。

1.2.3 饲养管理

试验期间每天正常投喂4次（07：00，11：00，17：00和21：00），投饵量为虾体质量的3%～5%，投喂1 h后观察对虾摄食情况调整投喂量。严格控制养殖用水质量，连续充氧，每日记录水温，检测氨氮、亚硝酸盐氮、溶解氧及pH值等水质指标，定期清理桶底残饵粪便。试验期间保持水温在（27.5±1.0）℃，ρ（氨氮）≤0.02 mg/L，ρ（亚硝酸盐氮）≤0.05 mg/L，ρ（溶解氧）≥5.5 mg/L，pH值为（7.6±0.3），盐度为（20±1.5）。试验周期为42 d，养殖期间出现的死虾需及时清理并记录。

1.2.4 生产性能测定

养殖试验结束后，对其饥饿处理24 h，将所有虾进行称量，计算终末平均体质量与平均体长（体长：从眼柄基部到尾节末端的长度）。计算成活率、质量增加率、增长率、特定生长率和饵料系数。计算公式如下：

成活率（%）=（末虾尾数/始虾尾数）×100；

质量增加率（%）=（末均质量-初均质量）/初均质量×100；

增长率（%）=（末均长-初均长）/初均长×100；

特定生长率（%）=（ln末均质量-ln初均质量）/饲养天数×100；

饵料系数=饲料摄入量（g，干质量）/虾体质量增加量（g，湿质量）

1.2.5 肠道微生物计数

试验结束后测定对虾肠道弧菌数及细菌总数。每组随机选取15尾虾，在无菌操作台内进行解剖，去除肠道内粪便，用无菌生理盐水冲洗干净，用滤纸吸干多余水分，置于灭菌玻璃匀浆器中，加入1 mL无菌生理盐水进行匀浆，对匀浆液进行梯度稀释，取0.1 mL分别涂布于Marine培养基和TCBS弧菌筛选培养基，每组涂布3个平板，28℃倒置培养24 h，统计菌落数。

每尾虾肠道细菌总数（TBC）按下述公式计算：

TBC（CFU）=细菌克隆数目×10×匀浆液稀释倍数/对虾尾数。

每尾虾肠道弧菌数（TCBS）按下述公式计算：TCBS（CFU）=弧菌克隆数目×10×匀浆液稀释倍数/对虾尾数。

1.2.6 非特异性免疫功能检测

非特异性免疫功能检测指标包括血细胞总数、酚氧化酶活力和超氧化物歧化酶活力。每组随机选取15尾（5尾×3重复）对虾，每个样品重复测试3次。

（1）血细胞总数。用一次性注射器抽取100μL含10%甲醛的0.45 mol/L NaCl溶液，按1∶1比例抽取对虾血淋巴，置于1.5 mL干净离心管中，用血球计数板进行细胞计数。采用的是25×16型（汤麦式）血球计数板，计数时数4个中方格和中央1个中方格的细胞数（即80个小格），计算公式为：每mL细胞数（个）=80个小格内细胞总数×5×10×稀释倍数。

（2）酚氧化酶活力。用ACD-BSolution抗凝剂按1∶1比例抽取对虾血淋巴，水平离心机800 g，4℃离心10 min，取10μL上清液，与10μL 0.3%的L-DOPA混合，在水浴锅中40℃条件下反应30 min，加入80μL 0.9%的NaCl溶液，充分混匀，酶标仪固定检测OD490的光吸收值，空白对照组用0.9%的NaCl溶液代替血清。每2 min测量1次，共测量10次，以OD490对反应时间作图，OD值每分钟增加0.001定义1个酶活力单位。

（3）超氧化物歧化酶活力。用ACD-B Solution抗凝剂按1∶1比例抽取对虾血淋巴2 mL，水平离心机800 g，4℃离心10 min，取上清液。根据Sigma-Aldrich超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒说明书进行测定。

1.3 数据处理及统计分析

原始数据使用Microsoft Excel 2019进行处理，再用SPSS 23.0统计软件对数据进行单因素方差分析，＜0.05表示差异显著，＜0.01表示差异极显著。试验数据采用“平均值±标准差”形式进行表示。

2 结果与分析

2.1 丁酸钠植物精油复合制剂对南美白对虾生长性能的影响

丁酸钠复合植物精油对南美白对虾生长性能的影响见表3，由表3可知，试验组南美白对虾增长率、质量增加率、特定生长率和成活率均显著高于对照组，与对照组比，试验组南美白对虾增长率升高11.73%（＜0.01），质量增加率升高13.58%（＜0.05），特定生长率显著升高6.92%（＜0.01），成活率显著升高5.83%（＜0.01），饵料系数显著降低18.24%（＜0.01）。

表3 丁酸钠复合植物精油对南美白对虾生长性能的影响①

2.2 丁酸钠复合植物精油对南美白对虾致病性弧菌的影响

丁酸钠复合植物精油对南美白对虾肠道总菌数与致病性弧菌的影响见表4，从表4可知，相比对照组，试验组的南美白对虾的肠道总菌数无显著变化，致病性弧菌则显著减少（＜0.01），减少幅度达68.3%。

表4 丁酸钠复合植物精油对南美白对虾肠道总菌数与致病性弧菌的影响① CFU/g

2.3 丁酸钠植物精油复合制剂对南美白对虾非特异性免疫的影响

丁酸钠植物精油复合制剂对南美白对虾非特异性免疫的影响见表5，由表5可见，相较于对照组，试验组的南美白对虾血细胞总数、酚氧化酶活力和超氧化物歧化酶活力均显著提高，分别提高11.45%（＜0.05），21.39%（＜0.01）和7.67%（＜0.01）。

表5 丁酸钠植物精油复合制剂对南美白对虾非特异性免疫的影响①

3 讨论

3.1 丁酸钠复合植物精油促进南美白对虾生长

丁酸钠可以促进水产动物的生长，提高生长性能。在斑节对虾饲料中添加包膜丁酸钠，能显著提高对虾质量增加率和饲料转化率。丁酸钠对美洲鳗鲡、罗非鱼、鲤和鲫均有显著促生长作用。丁酸钠的特殊气味也对水产动物具有良好的诱食作用。而植物精油能诱导水产动物主动进食，促进胃肠道兴奋，提高生产性能与饲料利用率。在南美白对虾饲料中添加0.02%的植物精油，能促进对虾采食，并且有效改善对虾的生长性能，维持肠道健康。Wigraiboon等发现鱼腥草油能够促进红罗非鱼生长，同时有效提高鱼肉的蛋白质含量，降低脂质含量，改善鱼肉品质。本试验发现，在南美白对虾饲料中添加丁酸钠复合植物精油，能显著提高对虾增长率、质量增加率和特定生长率，有效降低饵料系数，表明适量的丁酸钠复合植物精油能够促进南美白对虾的生长。

3.2 丁酸钠复合植物精油提高南美白对虾存活率

丁酸钠能促进肠道黏膜上皮细胞增殖，修复受损黏膜，促进肠绒毛增殖，增加隐窝深度，减少绒毛宽度，增强肠道对营养物质的消化吸收。植物精油同样可以改善肠道形态，选择性抑制某些有害菌群，促进有益菌群生长，维持肠道系统稳定。郑瑞耕在鲤饲料中添加丁酸钠，显著改善了鲤肠黏膜上皮完整度，肠绒毛粗壮。孙浪在鲫基础饲料中添加丁酸钠，显著提高了鲫前肠绒毛高度/隐窝深度的数值，有效促进了肠道细胞增殖。本试验中，试验组南美白对虾存活率显著高于对照组，表明丁酸钠复合植物精油增强了南美白对虾抵抗力。

3.3 丁酸钠复合植物精油有效抑制南美白对虾肠道内有害菌

弧菌属（）是一类菌体短小，略弯曲呈弧形，具有鞭毛的革兰氏阴性菌，该菌能生存于海洋和河口环境中，广泛存在于鱼类、珊瑚、对虾、浮游生物和哺乳动物中。目前已知几种弧菌对人类、鱼类和海洋无脊椎动物具有致病性，其中鳗弧菌（）是条件致病菌，可感染鲑鱼、大菱鲆、鲈、虹鳟、香鱼等并致其死亡，Lu等从患病青蟹中分离得到多种弧菌。有研究表明，在凡纳滨对虾饲料中添加丁酸钠能有效降低其肠道内弧菌数。崔惠敬等发现富含芳香醛、芳香酚和柠檬醛的植物精油对大菱鲆弧菌具有良好抗菌作用。本试验中，试验组的南美白对虾的肠道总菌数无显著变化，致病性弧菌则显著减少，表明丁酸钠复合植物精油能有效抑制肠道内有害菌。

3.4 丁酸钠复合植物精油能提升南美白对虾非特异性免疫力

多项研究证明，丁酸钠能促进动物免疫器官发育。在饲粮中添加植物精油可有效提高虹鳟血清中总补体含量和溶菌酶活性，植物精油还能通过增强抗氧功能提高动物免疫力。区别于哺乳动物，南美白对虾这类甲壳动物不具备特异性免疫，仅依赖于非特异性免疫来抵御病原体。南美白对虾血细胞总数、酚氧化酶活力和超氧化物歧化酶活力均是衡量对虾非特异性免疫力的重要指标。本研究中，试验组南美白对虾的血细胞总数、酚氧化酶活力和超氧化物歧化酶活力均显著上调，表明丁酸钠复合植物精油能显著提高南美白对虾的非特异性免疫力。

3.4.1 血淋巴细胞

作为甲壳动物免疫系统中最重要的部分，血淋巴细胞是发挥细胞免疫功能的主要物质。血细胞的吞噬作用主要是吞噬外界病原及异物颗粒，血细胞通过表面受体识别异物，触发由血淋巴细胞分泌的附着因子（如76 ku蛋白）介导的粘连，相互聚集成细胞团，以清除异物。日本对虾Rab基因已被证实可以作为一种胞内病毒识别蛋白，增强宿主细胞吞噬功能。

3.4.2 酚氧化酶

酚氧化酶是体液免疫中主要的杀菌物质之一，主要存在于颗粒或半颗粒细胞中，有助于黑色素的形成。已知黑色素能抑制病原体蛋白与酶活性的发挥，参与黑化反应，产生毒性醌杀灭病原，愈合伤口，也作为一种识别信号，诱导宿主防御系统中其他成分的产生，亦可作为调理素，影响细胞吞噬功能。

3.4.3 超氧化物歧化酶活性

甲壳动物血淋巴细胞在发挥免疫机制的过程中会产生大量活性氧，活性氧浓度过高则会损害机体健康。血细胞中的超氧化物歧化酶具有清除活性氧的作用，降低机体受损伤的可能性。其变化可作为动物免疫状态检测指标。

4 结论

综上所述，在南美白对虾饲料中添加适量丁酸钠植物精油复合制剂能够有效促进南美白对虾的生长，提高存活率，抑制致病菌的生长，增强对虾非特异性免疫力，从而提高南美白对虾养殖的经济效益。