王钱保， 姜润深， 黎寿丰， 黄华云， 李春苗， 黄正洋， 郭 兴， 赵振华

(1.中国农业科学院家禽研究所，江苏扬州 225003；2.安徽农业大学，安徽合肥 230000)

近年来，为分析密闭式鸡舍多环境因子对鸡生产性能的影响，专家们纷纷提出了基于鸡舍环境因子与生产性能相互影响的参数回归模型，其中，对于光照因素影响鸡性成熟的研究成为时下热点。光周期的变化衍生不同的内在生物节律，两者同步性对鸡性成熟产生影响。有研究指出，随光照模式的正向适度增加，鸡群生长和性器官发育均正向上升。潘栋研究表明，鸡体性成熟启动受光照时间和强度影响的同时，还与其是否符合鸡某一特定生长周期的昼夜生理节律相关。优质肉鸡的性成熟是一个体内多循环多通路协同合作的过程，目前对于参与触发性成熟启动的物质和相关机制仍处于不断完善之中，经验证可能有多种物质和信号通路参与其中。近年，随着鸡基因组测序的不断深化及高通量测序、分析技术快速发展，RNA-seq分析优质肉鸡在不同光照模式下性成熟期差异基因mRNA表达水平变化及其调控机制成为可能。因此，本研究在前期研究基础上，拟通过 RNA-seq 技术方法，揭示光照对优质肉鸡性成熟的分子调控机理，从而改善优质肉鸡生产繁殖性能，全面推动优质肉鸡产业优化升级。

1 材料与方法

1.1 试验材料及分组

2019年4月2日，挑选健康的来自江苏省家禽科学研究所自主培育的品系F系0日龄母鸡540羽，该品系群体生长整齐度高、性能优良。按每组180羽鸡随机分成3组(对照组CK、试验组T1和T2)，放于江苏省家禽科学研究所邵伯基地试验禽场内的3间密闭式鸡舍地面平养。各组鸡均在同一饲养条件统一执行优质肉鸡营养需求和一般免疫程序，全期自由采食和饮水。

1.2 试验方法

3组鸡试验在0～84日龄设计3种不同的光照模式，光照方案详见表1。由表1可知，试验周期为12周。于12周龄末时，每组采集3羽平均体质量鸡下丘脑组织样本放入无酶冻存管，编号后迅速放入液氮中保存，用于提取组织RNA进行RNA-Seq分析。Ⅰ组样品编号为CK-1、CK-2、CK-3，Ⅱ组样品编号为T1-1、T1-2、T1-3，Ⅲ组样品编号为T2-1、T2-2、T2-3。

表1 3 组优质肉鸡光照方案

1.3 转录组测序

1.3.1 RNA样本制备 采用Trizol法分别提取9个样品的下丘脑组织RNA，分别采用Nanodrop、Qubit2.0、Aglient 2100方法检测RNA样品的纯度、浓度和完整性等，以保证使用合格的样品进行转录组测序。通过常规试剂盒去除rRNA，将mRNA富集。进一步将富集得到的mRNA反转录形成双链cDNA，修复cDNA双末端后加上接头，PCR扩增构建上机文库。

1.3.2 文库制备 通过带有Oligo(dT)的磁珠富集具有polyA尾巴的真核mRNA后，采用超声波把mRNA打断，以片段化的mRNA为模版，随机寡核苷酸为引物，在M-MuLV逆转录酶体系中合成cDNA第一条链，随后用RNaseH降解RNA链，并在DNA polymeraseⅠ体系下，以dNTPs为原料合成cDNA第二条链。纯化后的双链cDNA经过末端修复，加A尾并连接测序接头，采用AMPure XP beads筛选200 bp左右的cDNA，进行PCR扩增并再次使用AMPure XP beads纯化PCR产物，最终获得文库。

1.3.3 文库质检和Illumina测序 为保证测序质量利用琼脂糖凝胶电泳分析样品RNA完整性及是否存在DNA污染；利用Nano Photometer spectrophotometer检测RNA纯度；利用Qubit2.0 Fluorometer进行RNA浓度精确定量利用Agilent 2100 bioanalyzer精确检测RNA完整性。为保证数据质量，要在信息分析前对原始数据进行数据过滤，过滤低质量数据以减少无效数据所带来的分析干扰，得到clean reads。文库质检合格后，交由基迪奥生物公司使用HiSeq2000测序仪(Illumina)进行转录组测序。

1.4 数据处理和统计分析

利用DESeq 2软件对基因表达水平进行分析，得到reads count数据，进行数据标准化(normalization)，根据模型进行假设检验概率(pvalue)计算，最后进行多重假设检验校正，得到FDR值(错误发现率)，最终得到组间的差异分析结果。使用R语言中的goseq包(12)将mRNA差异表达基因序列与GO(gene ontology)数据库进行比对分析，获得GO功能注释；将mRNA差异表达基因与KEGG(kyotoencyclopedia of genes and genomes)数据库进行BLASTX比对获得mRNA差异表达基因相对应的Pathway注释信息。

2 结果与分析

2.1 质控与数据总体分析

本研究对3组鸡下丘脑转录组测序，由表2可知，测序数据统计与序列比对分析结果，9个样品均获得了54×10条 reads以上，总碱基数5 Gb左右，Q20在98%以上，Q30在95%以上，说明RNA-seq测序结果可靠，可用于后续分析。样品比对到参考基因组上的reads均达总reads数约90%，比对率均较高。由表3可知，与所选鸡的参考基因组序列比较，共发掘新基因684个，其中，10个基因得到功能注释。

表2 3组测序数据统计与序列比对分析

表3 3组基因检测情况

2.2 样本关系分析

使用皮尔逊相关系数对样品进行相关性分析，由图1可知，试验组组间3个生物学重复的决定系数()均大于0.95，对照组组间的决定系数()均在0.91以上，表明样品组成相似性高，分析结果相关性较强。

2.3 差异基因整体分析

基于差异分析结果，筛选FDR<0.05 且 log|FC|>1 的基因为显著差异基因，由图2可知，各比较组显著差异基因整体统计，对照组与试验组T1、T2及试验组T1与T2间的mRNA显著差异表达基因数量均不超过21个，但对照组与试验组T2的mRNA显著差异表达基因数量超过189个，相比于对照组，试验T2组有111个基因上调表达、78个基因下调表达。差异表达基因聚类分析结果见图3。由图3可知，大多数基因聚集在同一大类上，提示这些差异表达的基因具有特定的功能相关性。

2.4 差异基因GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析

分别对3组鸡组织的上调差异基因、下调差异基因进行GO分析和KEGG信号通路富集分析，对照组和试验组T1、T2分别富集到36个和45个显著GO条目。由图4可知，其中，富集较多的GO功能是正负调控的生物过程、信号传递、细胞分解过程、新陈代谢过程、脂质代谢相关过程和免疫相关过程。其中，信号传导、机体新陈代谢及细胞过程在机体性成熟过程富集到了多个上调或下调基因，由表4可知，其中表达最为显著的有抑制性神经递质的褪黑素受体基因()、兴奋性神经递质瘦素受体基因()、影响中枢神经系统中最主要的神经递质多巴胺受体基因()等。

表4 优质肉鸡差异基因GO功能富集情况

由图5可知，KEGG信号通路富集分析发现有5条显著富集的KEGG信号通路，分别为机体新陈代谢、组织代谢、细胞分解过程、内环境信息表达、基因表达过程通路。这些通路相互作用、相互影响，共同参与了机体的生长发育、性成熟等生命周期活动。

3 讨论

近年，转录组测序技术不断深化，家禽测序体量和质量都有巨大提升。本研究测序获得的原始序列均超过54×10条，总碱基数6 Gb左右，Q20碱基在98%以上，Q30碱基在95%以上，测序数据质量较高。与所选鸡的参考基因组序列进行对比，共发掘新基因684个，其中，10个基因得到功能注释。试验组组别间的3个生物学重复的决定系数()均大于0.95，对照组组别间的决定系数()均在0.91以上，表明样品组成相似性高，后续分析结果相关性较强。

光照作为调节家禽行为活动中性成熟的一项重要节律模式，其是通过视网膜双感受器共同感知以达到对光周期的控制，促进机体形成特定的生物节律，从而平稳有序地调控家禽性成熟活动。研究报道，家禽视网膜感受光照的刺激后，产生光信号经“视网膜-下丘脑神经束”传递至视交叉上核转化为神经冲动，此过程通过来自性腺轴调控的神经内分泌调节，引起家禽体内促黄体素(LH)和促卵泡素(FSH)等一批性腺激素产生变化，最后影响家禽的性成熟等行为活动。家禽生产中，养殖者重点关注光照变化致使优质肉鸡体质量和脂肪沉积等是否合格，而易忽视其对性腺发育的影响，现有研究已经表明，优质肉鸡不同生长阶段的生理特点差异较大，对光照时间长短反应不同，须在不同的生长阶段采用不同的光照节律，否则便会引起优质肉鸡性早熟或开产延迟等情况。

本研究差异表达基因对比分析结果表明，对照组与试验组T2的mRNA显著差异表达基因数量超过189个，表明了对照组与试验组T2由于不同的光照模式影响，导致了机体的生长发育在基因层面差异较大。在表达差异最显著的基因中，与内外环境的节律调动过程和体内信号转导有关的基因表达最为活跃。近年来，有研究发现褪黑素在动物性成熟、激素分泌等过程中发挥着重要作用。褪黑素作为一种内分泌胺类激素，其分泌受光照影响呈现出昼低夜高的节律性，能够抑制性激素分泌，如可以抑制HPG轴的水平，通过抑制促性腺激素释放激素(GnRH)的释放来调节机体的生殖功能，而下丘脑是促性腺激素释放激素(GnRH)分泌的整合单位，是促黄体生成素和促卵泡生成素适时释放的信号。此外作为抗性腺作用的主要靶器官，在性成熟过程中同样发挥着巨大作用。因此，在肉种鸡生产中，可以考虑通过补充外源性褪黑素适宜地延迟不同品种、不同育种目标肉种鸡性成熟时机，以达到最大化生产目的。瘦素作为影响家禽生殖系统的一个重要信号，待性器官发育到一定阶段后，在体内释放随后进入血液的含量不断增加，促进了促性腺激素的分泌，导致了性腺类固醇激素的持续上升，进而影响开启性成熟的启动周期。多巴胺通过兴奋多巴胺受体抑制垂体中血管活性肠肽(VIP)和催乳素(PRL)等多种相关激素的分泌，具有强烈抑制促性腺激素释放以及刺激促生长激素分泌的作用，从而对鸡的性成熟启动起到积极的调控作用。GO和KEGG功能测序分析结果表明，3组鸡富集到了多条显著GO条目，KEGG信号通路富集分析提示，信号传递、新陈代谢和细胞过程等在机体性成熟过程中发挥了重要作用。量多而繁复的复杂通路多与机体生长发育、性成熟启动密切相关，连接通路的这些上调或下调基因和多种性腺激素相互协作、相互制约，所产生的多种生理、药理反应可作用于鸡体内多个循环系统，其中，包括内分泌系统、免疫系统和神经系统，进而也会影响鸡的昼夜节律、性成熟启动以及生殖行为，呈现后续的一系列机体应答反应。

4 结论

优质肉鸡不同生长阶段的光照模式对其性成熟的影响较大，主要是通过上调或下调与信号传递和机体新陈代谢等信号通路相关基因的表达，从而影响优质肉鸡性成熟发育，最终实现生产性能的综合调控。