陶德良，赵姗姗，陈 曦，陈金铭，杨 新，宋军科，赵光辉

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

新孢子虫(Neosporacaninum)是一种专性细胞内寄生原虫，在世界范围内广泛分布，可感染犬、牛、羊等多种哺乳动物。新孢子虫感染会引起新生犊牛神经系统紊乱以及孕畜的流产和死胎，是引起牛繁殖障碍的一种重要病原，给世界养牛业带来了较为严重的经济损失。研究发现，新孢子虫感染导致的流产与母胎界面的炎症以及免疫反应有关[1-2]，但具体的致病机制仍不够清楚。目前，国内对于新孢子虫致病机制的研究集中在Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)、Nod样受体(Nod-like receptors，NLRs)等先天免疫中的一些模式识别受体以及NF-κB(nuclear factor kappa-B)、MAPK(mitogen-activated protein kinase)等先天免疫中的经典通路在新孢子虫感染中的作用，并且有研究表明一氧化氮(nitric oxide，NO)、γ干扰素(interferon-γ，IFN-γ)等在新孢子虫感染中也发挥着巨大的作用，但是关于新孢子虫与凋亡、自噬、内质网应激、氧化应激以及microRNA等在新孢子虫感染中的调控作用的研究十分有限，仍需要大量的基础科学研究来探讨相关的机制。本文将在新孢子虫感染过程中宿主如何通过模式识别受体识别新孢子虫的感染、并进一步调控相关信号通路以及细胞免疫来抵抗新孢子虫感染方面作以概述，以期为新孢子虫病的研究提供参考。

1 模式识别受体在新孢子虫感染中的作用

先天免疫(innate immunity)是机体免疫系统的第一道防线，在抵抗病原感染与增殖中发挥着重要作用，同时参与抗原的识别与递呈，并与获得性免疫(adaptive immunity)应答联合作用来清除病原微生物感染。在先天免疫中，一些免疫细胞可以通过模式识别受体(pattern recognition receptor，PRRs)识别病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)或者损伤相关分子模式(damage-associated molecular pattern,DAMPs)，当这些模式受体被激活后，可以产生级联反应，激活相应的信号通路，并促使吞噬细胞聚集，产生促炎细胞因子，同时PRRs也会参与诱导适应性免疫细胞(特别是T淋巴细胞)的共刺激信号[3]。目前研究的PRRs主要包括Toll样受体、NOD样受体、C型凝集素受体(C-type lectins receptors，CLRs)和RIG 样受体(RIG-like receptors，RLRs)[3]。在新孢子虫感染中，TLRs中的TLR2和TLR3在抑制新孢子虫的增殖以及控制炎症方面发挥着重要作用；NLRs家族中的成员可以组装为炎症小体参与新孢子虫的清除。目前对于CLRs与RLRs的研究十分有限，但也有研究发现，CLRs中的Dectin-1可以抑制新孢子虫的增殖以及控制炎症的发展。

1.1 TLRs

TLRs是一类跨膜糖蛋白，主要表达于单核巨噬细胞、树突状细胞、T细胞和B细胞等免疫细胞，TLRs主要通过识别病原微生物一些固有成分来参与机体的先天免疫应答。关于TLRs在新孢子虫感染中的作用研究日益增多，尤其集中在TLR2和TLR3。研究发现，在小鼠巨噬细胞体外感染模型中检测到TLR3和TRIF的上调，敲除TLR3和TRIF的小鼠出现新孢子虫荷虫量增加与炎症病变加剧，表明TLR3-TRIF增强了小鼠对新孢子虫感染的抵抗力，并且当TLR3-TRIF靶向宿主的溶酶体时，新孢子虫会激活TLR3依赖的Ⅰ型干扰素的免疫应答[4]。在感染新孢子虫的牛羊中同样检测到TLR3的上调，新孢子虫感染的妊娠母牛在胎盘和脾脏组织以及胎儿中均可以检测到TLR3/7/8的上调表达，这与灭活的可溶性全抗原或者重组NcSAG1、NcHSP20或NcGRA7蛋白免疫后的效果一致[1]；同样Nc-Spain7和Nc-Spain1H这2种虫株感染牛均能够上调TLR2的表达，这可能与新孢子虫的糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)的毒性作用有关[5]。此外，暴露于新孢子虫的小鼠腹腔巨噬细胞TLR2和TLR11表达上调，TLR2/MyD88依赖的抗原递呈细胞成熟以及促炎因子增多[6]，且TLR11介导的MEK-ERK信号通路会迅速激活，进而导致白细胞介素12p40(interleukin-12p40，IL-12P40)的上调表达[7]。由此可见，宿主TLRs在介导新孢子虫感染引起的免疫反应中发挥着重要作用，新孢子虫激活的TLRs可以通过MyD88依赖途径以及TRIF依赖途径等接头分子来调控下游NF-κB、MAPK等信号通路以及促进IFN、IL等一些炎性因子的表达来发挥抗新孢子虫感染的作用。目前关于新孢子虫与TLRs的研究集中在TLR2和TLR3。在TLRs中，TLR4介导的MyD88依赖途径激活NF-κB在先天免疫中也是经典途径之一，那么新孢子虫会不会上调TLR4的表达来参与先天免疫呢？TLR9能够识别一些CpG DNA，新孢子虫感染会不会导致一些低甲基化和非甲基化的DNA或者mtDNA到胞质中从而激活TLR9诱导免疫细胞的炎症反应仍有待探讨。

1.2 NLRs

Nod样受体又称核苷酸结合寡聚化结构域样受体，是一类胞浆病原模式识别受体，主要在一些免疫细胞中表达，如吞噬细胞和树突状细胞，其功能与其他模式识别受体类似，识别病原微生物的固有成分，从而激活先天免疫中的信号通路，目前有关Nod样受体在新孢子虫中的研究有限，但是Nod 2在抵抗新孢子虫入侵中发挥着重要作用，小鼠巨噬细胞暴露于新孢子虫后，检测到Nod 2表达上调并与胞内纳虫泡共定位；而敲除Nod 2小鼠的MAPK通路的激活被抑制以及新孢子虫的荷虫量增加[8]。除此之外，NLRs家族具有其他模式识别受体所不具备的功能，NLRs可以充当支架蛋白，在胞质内招募ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD)，ASC通过与caspase-1结合组装形成炎症小体(inflammasome)。对于新孢子虫而言，NLRP3炎症小体是研究最多的，新孢子虫感染的骨髓源性巨噬细胞(bone marrow-derived macrophage，BMDM)激活NLRP3炎症小体，血清中IL-18和IFN-γ升高，增强Th1型反应，限制新孢子虫增殖，表明NLRP3有助于新孢子虫的清除[9]。

1.3 CLRs

C型凝集素受体也是机体内一类重要的PRRs，主要在一些抗原递呈细胞中表达，如树突状细胞和巨噬细胞，参与介导多种生物学效应，包括识别病原微生物、激活补体以及吞噬作用等[10]。研究发现，CLRs中的Dectin-1在新孢子虫感染中发挥着重要作用，新孢子虫感染的Dectin-1-/-小鼠的神经系统炎症与虫体荷虫量均出现下降，且IL-12p40也出现上调表达[11]，提示Dectin-1与新孢子虫的清除有关。

1.4 其他相关受体

表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)具有内在的酪氨酸激酶活性，当EGFR被激活后，能够活化其内在的酪氨酸激酶活性，磷酸化下游的信号分子，激活包括PI3K/AKT、MAPK等在内的多种信号通路，调控细胞生长、增殖与凋亡[2]。研究发现，新孢子虫感染会激活EGFR-AKT和EGFR-MAPK信号通路，进而介导宿主细胞的凋亡，清除入侵的新孢子虫[2]，可能与凋亡在抵抗病原微生物中的作用有关。此外，在新孢子虫感染的小鼠中，趋化因子受体CCR5(CC-chemokine receptor 5)被激活，并诱导单核细胞迁移到感染部位，而敲除CCR5小鼠的自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)和树突状细胞的迁移率大大下降，且死亡率增加[12]，提示在新孢子虫入侵的过程中，CCR5对于炎症的控制有一定的作用。

2 新孢子虫感染激活宿主先天免疫

2.1 NF-κB通路

NF-κB通路是天然免疫中一条经典的炎症相关通路，NF-κB家族包括5个成员，Rel A(p65)、Rel B、c-Rel、NF-κB1(p50)和NF-κB2(p52)，它们可形成同源或者异源二聚体入核调控相应的靶基因来发挥生物学效应，尤其是在炎症反应中，从病原体的识别到促炎细胞因子的产生都依赖NF-κB途径[13]。近年来的研究发现，NF-κB在原虫感染中发挥着重要作用，新孢子虫感染牛巨噬细胞的转录组分析表明，新孢子虫感染激活了NF-κB通路，而灭活的新孢子虫速殖子则不能激活NF-κB通路，提示NF-κB可能在新孢子虫入侵过程中引起巨噬细胞炎症反应。有趣的是，新孢子虫致密颗粒蛋白6(NcGRA6)和14-3-3重组蛋白激活了NF-κB通路，引起核内NF-κB/p65蛋白水平的升高[14-15]。

2.2 MAPK通路

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPKs)是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在所有的真核细胞中均有表达，主要分为细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)、Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNKs)、p38 MAPK 和ERK5 4个亚家族。当MAPK通路激活后，可以磷酸化下游蛋白，从而调控细胞的生长分化、应激与炎症等过程[16]。研究发现，MAPK通路的激活与新孢子虫感染宿主的免疫应答密切相关，新孢子虫果糖-1,6-二磷酸酶(NcFBPase)与14-3-3重组蛋白均可以激活MAPK途径，显著提高p38和ERK蛋白的磷酸化水平，并且诱导IL-12p40和TNF-α等细胞因子的释放[15]，通过TLRs的串扰反应也可以活化MAPK信号通路，新孢子虫感染激活TLR11-Myd88依赖的MEK-ERK信号途径，增加促炎因子的表达，减少新孢子虫荷虫量[7]。这些研究说明，MAPK信号通路在新孢子虫入侵中可能发挥着正向调节作用。

2.3 其他相关信号通路

Ca2+作为机体内重要的第二信使，是机体内信号网络的重要一环，可通过钙传感蛋白调节不同的生物学效应，尤其是在顶复门原虫的入侵过程中，Ca2+调控着虫体的滑行运动和微线体分泌等生理过程，而CDPKs(calcium-dependent protein kinases)是机体内的一种钙传感蛋白，在顶复门寄生原虫钙信号的传导中发挥着重要作用，CDPKs介导的钙离子信号传导对于顶复门原虫(如疟原虫、弓形虫等)的入侵具有重要作用[17]。目前，关于钙依赖蛋白激酶与新孢子虫的作用也有研究，钙依赖蛋白激酶抑制剂处理的感染新孢子虫的孕鼠中，脑中寄生虫荷虫量降低并且幼崽的生存率提高[18]，提示CDPK可能是治疗与防控新孢子虫病的一个新的靶点。感染新孢子虫的牛单核细胞的微阵列分析发现，STAT被磷酸化，JAK-STAT途径上的相关基因出现上调表达，并且新孢子虫ROP16蛋白也能够直接诱导STAT3发生磷酸化和核移位，最终引起细胞凋亡[19]。

2.4 中性粒细胞胞外诱捕网

中性粒细胞作为一种吞噬细胞，在先天免疫中发挥着巨大作用，如吞噬清除病原体以及形成中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps，NETs)等。NETs是宿主对抗病原微生物的感染以及炎症反应的一种新型效应机制。研究发现，NETs在脊椎动物和无脊椎动物中广泛存在，它不仅可以捕获微生物与病毒，还可捕获一些原虫，如恶性疟原虫(Plasmodiumfalciparum)、微小隐孢子虫(Cryptosporidiumparvum)等[20]。新孢子虫同样可以触发NETs，在羊中性粒细胞中检测到新孢子虫速殖子与NETs的共定位，且弹性蛋白、髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)、钙离子、ERK1/2和p38 MAPK等分子或信号通路均参与新孢子虫诱导的胞外诱捕网的形成，捕获新孢子虫速殖子[21]，作为一种捕获病原体的效应机制，NETs可以通过不同的信号途径被触发在清除新孢子虫中发挥一定的作用。

2.5 活性氮

一氧化氮(nitric oxide,NO)作为一种炎症分子，在抵抗新孢子虫入侵中发挥着重要的作用，尤其是介导炎症反应和降低新孢子虫的荷虫量，新孢子虫感染小鼠可以诱导NO的产生，进而调节炎症反应，限制新孢子虫在小鼠体内的增殖，而抑制一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的活性，则会刺激新孢子虫的增殖[22]，说明依赖于NO的杀伤作用对于新孢子虫的增殖具有抑制作用。

3 细胞免疫应答

T细胞介导的细胞免疫(cellular immunity)对于病原微生物的清除十分重要，尤其是新孢子虫，作为一种胞内寄生的原虫，体液免疫对其作用不大，细胞免疫才是关键。细胞免疫一方面可通过细胞因子来调节免疫反应，尤其是IFN-γ，被认为是新孢子虫及其他胞内寄生原虫感染机体的救命分子，在抗病原微生物以及控制炎症过程中发挥着重要作用[6]，另一方面，细胞免疫可由CD8+T细胞分泌穿孔素和颗粒酶，通过死亡配体途径诱导细胞凋亡产生细胞毒性杀伤，这对于胞内病原微生物的杀伤十分重要。但是，T细胞介导的免疫应答的特征是出现以单核巨噬细胞浸润为主的炎症反应和特异性的细胞毒性，这些强烈的炎症反应可能导致母畜妊娠期间流产。

模式识别受体不仅在先天免疫中发挥作用，TLR2还可以通过激活Th1型免疫应答，促进CD4+和CD8+T细胞增殖，诱导γ干扰素、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和IL-12分泌，限制寄生虫增殖[6]。此外，新孢子虫14-3-3蛋白可以激活Th1型免疫应答，促进IFN-γ的分泌，对急性新孢子虫感染具有一定的保护作用[23]。研究发现，在新孢子虫感染的妊娠绵羊和奶牛中，胎盘中的CD4+和CD8+T细胞浸润以及IFN-γ显著上调表达[24]。高毒力(Nc-Spain7)和低毒力(Nc-Spain1H)的犬新孢子虫株均可以导致外周血中CD4+与CD8+T细胞的增加，但妊娠后期炎症免疫反应弱于早中期[25]，这可能与新孢子虫病由急性期转为慢性期有关。

4 展望

随着CRISPR-CAS9、多组学测序分析等技术的广泛应用，学者们越来越关注新孢子虫与宿主的互作机制研究。尽管目前已发现宿主可通过多种途径调控先天免疫和适应性免疫来抵抗新孢子虫的感染，但关于新孢子虫的致病机制研究仍有许多未解之谜，如新孢子虫如何诱导宿主细胞凋亡以及逃避宿主免疫的方式、新孢子虫速殖子和缓殖子之间相互转换的分子基础、新孢子虫引起孕畜流产的分子机制以及导致新生儿神经紊乱的机制等，这些科学问题的解决将为发掘新的防控新孢子虫病药物靶标和疫苗候选分子提供重要理论指导。