以善佳，李慕军，马文红,3*

(1.广西医科大学第一附属医院，南宁 530022；2.桂林医学院附属医院，桂林 541001；3.柳州市妇幼保健院，柳州 545002)

人类辅助生殖技术(ART)是通过各种医疗辅助手段帮助不孕不育夫妇获得妊娠与活产的技术，由于促排卵技术的广泛应用，以及全胚冷冻策略的兴起，体外受精-胚胎移植(IVF-ET)助孕过程中卵母细胞和胚胎冷冻现象越来越普遍，且不同时期卵母细胞及胚胎的冷冻保存和复苏是IVF技术的一个重要环节。卵母细胞和胚胎的冷冻方法主要分为玻璃化冷冻和程序化冷冻。相对于程序化冷冻，玻璃化冷冻复苏操作更加简单，不需要使用昂贵的程序冷冻仪，条件更容易满足，冷冻速度更快[1]。玻璃化冷冻复苏技术已被广泛运用于各个生殖中心，但是玻璃化冷冻对于卵母细胞、胚胎及其相关DNA甲基化、基因组印迹和组蛋白修饰等表观遗传修饰的影响，目前仍知之甚少。本文就这一问题进行相关文献复习和总结，期望为改善玻璃化冷冻后卵母细胞及胚胎质量的实验及临床活动提供理论依据。

一、玻璃化冷冻在ART中的应用背景

在上世纪80年代，“玻璃化冷冻”技术首次问世。Rall等[2]研究发现，高浓度冷冻保护剂及极速降温的方法可减少小鼠胚胎在冷冻过程中冰晶形成，避免冰晶对胚胎损伤，从此开启了世界各国对动物及人类胚胎及配子玻璃化冷冻的实验研究及探索。随着冷冻保护剂的不断改善以及冷冻技术的进步，玻璃化冷冻已广泛应用于卵裂期及囊胚期胚胎冷冻，也是临床生育力保存中的主要应用技术[1，3-4]。卵母细胞因其细胞结构特殊性导致玻璃化冷冻的临床应用时间及范围远不及胚胎，近几十年卵母细胞玻璃化冷冻技术已不断改进，取得了质的飞跃。陈子江教授团队报道了我国第1例卵母细胞经玻璃化冷冻复苏后受精，患者成功受孕并分娩一对双胞胎[5]。孙贤等[6]通过回顾其中心玻璃化冷冻卵母细胞行卵胞浆内单精子注射-胚胎移植(ICSI-ET)患者的临床资料，发现经玻璃化冷冻的卵母细胞可获得与新鲜卵母细胞相近的临床结局。虽然卵母细胞及胚胎玻璃化冷冻相比于过去的程序化冷冻有较好的临床结局，但由于卵母细胞及胚胎的玻璃化冷冻过程中需使用高浓度的冷冻保护剂以及许多人为干预操作，因此玻璃化冷冻对卵母细胞和胚胎的质量、临床结局和子代的安全性是否有不良影响而备受关注和重视。

二、卵母细胞玻璃化冷冻对胚胎及子代的影响

1999年，Kuleshova等[7]首次报道运用开放式拉细麦管对人类卵母细胞玻璃化冷冻及复苏，再行ICSI获得可移植胚胎并使患者顺利分娩一健康子代。动物实验表明，相较于传统程序化冷冻，小鼠MⅡ期卵母细胞经玻璃化冷冻后存活率更高，保存效果更好；而玻璃化冷冻卵母细胞解冻后更容易形成8细胞期胚胎和囊胚[8]。

1.卵母细胞玻璃化冷冻对胚胎的影响：与新鲜卵母细胞相比较，哺乳动物卵母细胞玻璃化冷冻复苏过程会导致卵母细胞损伤[3，9]。卵母细胞经玻璃化冷冻后可出现空泡增多、线粒体-平滑内质网与线粒体-囊泡复合物聚集以及皮质颗粒增多等超微结构改变[10]。Cobo等[11]研究显示，玻璃化冷冻复苏后卵母细胞发育到囊胚期的速度减慢，但胚胎着床率并无明显改变。在胚胎发育质量与发育潜能上，小鼠卵母细胞经玻璃化冷冻后其卵裂率和囊胚率下降[12]。近期研究结果显示，人卵母细胞玻璃化冷冻复苏后再行ICSI治疗，冷冻组优质胚胎率较新鲜组明显下降[13]，说明卵母细胞玻璃化冷冻可能会降低胚胎发育潜能。Chamayou等[14]使用植入前遗传学诊断(PGD)技术对玻璃化冷冻卵母细胞发育的囊胚进行整倍体分析，结果表明其囊胚整倍体率和非整倍体率与新鲜卵母细胞发育囊胚无统计学差异。

2.卵母细胞玻璃化冷冻对子代的影响：因为人类卵母细胞玻璃化冷冻技术应用时间较短，目前并没有其相关儿童健康的长期跟踪研究，因此分析围产期结局以及出生儿童发育有利于排除该项技术对后代的不利影响。国内外研究显示，经玻璃化冷冻卵母细胞出生儿童与新鲜卵母细胞出生儿童相比，其出生体重、新生儿出生缺陷率、围产儿死亡率等结局均无统计学差异[11，13]。

总之，以往研究虽然显示卵母细胞玻璃化冷冻后其超微结构、胚胎发育速度及发育潜能有所改变，但妊娠结局、新生儿情况与新鲜卵母细胞相比无显著差异，且卵母细胞玻璃化冷冻后胚胎形成和胚胎质量优于程序化冷冻，这些也初步证明了卵母细胞玻璃化冷冻的安全性及有效性。当然，玻璃化冷冻技术在人类卵母细胞的应用仍是近10～20年的事情，其远期风险不详，仍需要进一步密切观察评估。

三、胚胎玻璃化冷冻对妊娠结局及子代的影响

人类胚胎玻璃化冷冻技术的开展稍早于卵母细胞玻璃化冷冻技术。1998年日本学者Mukaida等[15]已经报道了世界首例通过玻璃化冷冻技术冻存并复苏人类胚胎从而使患者获得成功妊娠及胎儿分娩。

1.胚胎玻璃化冷冻对胚胎发育的影响：目前研究显示，不同时期小鼠胚胎经玻璃化冷冻对胚胎的存活率影响不一。与新鲜胚胎相比，2细胞期小鼠胚胎经玻璃化冷冻后胚胎发育速率较低，但是囊胚形成率没有显著下降[16]。而8细胞期胚胎经玻璃化冷冻可导致小鼠胚胎存活率下降[17]。与程序化冷冻相比，人类胚胎经玻璃化冷冻可显著提高胚胎复苏率和胚胎利用率，胚胎存活率通常高于95%，并且可以从受精卵到囊胚期的任何阶段进行玻璃化冷冻保存，但最有效且对患者最有利的冷冻保存阶段是囊胚期[3，18]。重要的是，人类胚胎玻璃化冷冻复苏后移植并不增加胚胎染色体核型异常的发生率[19]。

2.胚胎玻璃化冷冻对妊娠结局的影响：与新鲜胚胎移植组比较，胚胎玻璃化冷冻组在胚胎着床率、临床妊娠率、多胎妊娠率、流产率等临床结局上均无明显差异，甚至有更高的胚胎着床率和临床妊娠率，而胚胎玻璃化冷冻组单胎分娩新生儿早产率较新鲜胚胎移植组增高[3，20]。

3.胚胎玻璃化冷冻对子代的影响：目前关于玻璃化冷冻复苏胚胎移植对子代影响的研究尚存在较多分歧。有研究显示，与新鲜胚胎移植比较，玻璃化冷冻复苏胚胎移植并未增加子代出生缺陷的风险[19]。另一项研究结果则认为，玻璃化冷冻复苏胚胎移植会增加子代巨大儿发生率[21]。而小鼠胚胎研究显示，冻胚移植子代小鼠在性成熟期脂肪含量高于鲜胚移植或自然交配产生的子代小鼠[22]。

综上所述，相较于新鲜胚胎移植，胚胎经玻璃化冷冻复苏后移植并未降低胚胎着床率，未增加胚胎染色体异常发生率，但对子代出生缺陷的风险尚不明确，并且有可能对子代后期的生长发育存在负面影响。除此之外，胚胎玻璃化冷冻是否会对母婴结局有其他影响需加强后续子代的长期随访研究。

四、玻璃化冷冻对卵母细胞、胚胎影响的相关表观遗传学改变

为了更透彻的认识卵母细胞及胚胎经玻璃化冷冻后对胚胎质量、生育结局及子代的影响，研究者们从分子层面探索玻璃化冷冻对卵母细胞和胚胎的影响机制。目前研究发现，玻璃化冷冻不会引起DNA序列的改变，但可导致核苷酸序列不发生改变的情况下基因表达水平的可遗传变化即表观遗传修饰的变化，这种基因表达水平的改变可以在一生中都非常稳定，或只在生长发育过程中发生短暂变化[23]。胚胎形成期表观遗传修饰的改变是目前研究的热点。常见的表观遗传修饰改变包括但不限于DNA甲基化、基因组印迹、组蛋白修饰、染色质重塑、非编码RNA调控等一系列DNA和染色质修饰[24]，最常见的是DNA甲基化和组蛋白修饰，而基因组印迹的分子机理与DNA甲基化、组蛋白修饰密切相关。

1.DNA全基因组甲基化：在受精卵到囊胚的发育过程中，母本和父本基因组均不可避免的经历DNA去甲基化到再次建立DNA甲基化的过程，而配子和胚胎玻璃化冷冻与其关系密切。

目前卵母细胞经玻璃化冷冻后是否引起胚胎全基因组甲基化水平改变尚无定论。De Munck等[25]发现，与新鲜卵母细胞比较，经玻璃冷冻后人类卵母细胞以及发育至第3天的胚胎其全基因组甲基化水平均无明显改变。然而一些研究结果则相反，显示小鼠卵母细胞玻璃化冷冻会导致其DNA甲基化水平显著下降[26-27]。

与卵母细胞不同，多项研究结果均显示，胚胎经玻璃化冷冻后其整体甲基化水平发生显著变化。Movahed等[16]研究显示，小鼠2细胞胚胎经玻璃化冷冻后，囊胚形成率没有显著下降，但胚胎DNA甲基化水平稳步下降。Yao等[28]研究表明，小鼠8细胞胚胎经玻璃化冷冻后其囊胚形成率没有显著下降，但8细胞胚胎及囊胚DNA甲基化水平明显下降。

2.基因组印迹：基因组印迹又称为遗传印迹、亲代印迹或配子印迹，是指在配子或合子发生期间，来源于亲本染色体或等位基因发生的独特改变和修饰，使父本或母本的某一方等位基因被沉默，导致其子代体细胞中来自于父本和母本等位基因出现表达活性差异。因此，具有这种差异的基因被称为印迹基因。基因组印迹的分子机理与DNA甲基化、组蛋白修饰密切相关。

H19基因是父源印迹而母源表达的印迹基因，胰岛素样生长因子2(IGF2)基因是母源印迹基因并与H19基因紧密相连，受同一个差异性甲基化区域(DMR)调控[29]。大量实验研究证明，玻璃化冷冻会影响配子及胚胎基因组印迹水平[29-30]。在胚胎早期发育过程中，印迹首先在初级生殖细胞中被擦除，在配子发生期间重新建立，然后在后期的胚胎发育以及胎儿生长至成年保持不变[31]。因此在受精卵形成至胚胎早期，H19基因与IGF2基因表达是一个动态变化的过程。玻璃化冷冻胚胎会导致H19和IGF2基因异常甲基化。H19基因异常低甲基化状态或高甲基化状态均可导致胎儿发育异常，与胎儿生长受限综合征(SRS)及胎儿生长过度综合征(BWS)密切相关[32]。Wang等[29]实验结果显示，小鼠桑椹胚经玻璃化冷冻复苏后移植可导致胎鼠H19基因甲基化水平下降。而另一项实验结果则表明，玻璃化冷冻小鼠胚胎可导致胚胎存活率较新鲜胚胎下降，着床后胚胎H19基因表达水平明显增高；但H19基因水平变化并未出现在后期胎盘组织中，并且玻璃化冷冻并未改变小鼠胚胎及胎盘H19基因甲基化水平[17]。卵母细胞及早期胚胎的玻璃化冷冻是否会导致H19基因异常甲基化状态，还需进一步实验验证。

母源性印迹、父源性表达印迹基因Peg3、Peg10与参与促进胎盘发育的C2H2型锌指蛋白生成密切相关[33]。动物实验研究显示，小鼠卵母细胞经玻璃化冷冻后Peg3甲基化水平无明显改变，但其囊胚Peg3-DMR甲基化水平显著下降[30]；而小鼠卵母细胞经玻璃化冷冻后Peg10表达水平显著上升，相反IGF2R基因表达水平明显下降[34]。同样是母源性印迹、父源性表达的小核核糖核蛋白N(Snrpn)印迹基因，与细胞分化、增殖、胚胎正常发育有关[35]。印迹基因Snrpn的异常甲基化状态与Prader-Willi综合征、Angelman综合征有关[36-37]。姚建凤等[35]发现，与正常妊娠妇女分娩后胎盘组织比较，接受IVF-ET治疗的妇女新鲜周期组和玻璃化冷冻组胎盘组织Snrpn mRNA水平和蛋白质水平均表达增高，但新鲜周期组和玻璃化冷冻组组间差异无统计学意义。相关研究显示，玻璃化冷冻一定程度上可影响卵母细胞、胚胎甚至胎盘中Peg3、Peg10、Snrpn等印迹基因的表达。

3.组蛋白修饰：基因被组蛋白包裹会影响其与转录复合物结合，影响基因转录。若想开启基因转录表达，需要改变组蛋白修饰状态，使其和DNA的结合变得松弛才能实现。常见的组蛋白修饰包括乙酰化、甲基化、泛素化、磷酸化等[38]，而目前研究与卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻相关的组蛋白修饰主要为组蛋白乙酰化和甲基化。

组蛋白乙酰化：组蛋白乙酰化是组蛋白表观修饰方式之一，组蛋白乙酰化和去乙酰化状态主要由组蛋白乙酰基转移酶(HATs)与去乙酰基酶(HDACs)这两类乙酰化修饰酶共同作用而达到平衡。当组蛋白乙酰化与去乙酰化、HATs和HDACs之间的平衡异常，则会影响DNA复制和转录过程，导致卵母细胞及胚胎发育异常。有文献报道，玻璃化冷冻会增加小鼠MⅡ期卵母细胞中组蛋白H4K12[39]和H3K9[40]的乙酰化水平，降低小鼠MⅡ期卵母细胞HDAC1[40]水平。相对较低组蛋白乙酰化水平是玻璃化冷冻卵母细胞成熟能力的关键，低HDAC6水平的小鼠卵母细胞玻璃化冷冻后存活率、卵裂率和囊胚形成率均降低，用HDAC6反义转染卵母细胞可显著提高卵母细胞玻璃化冷冻后的存活率、卵裂率和囊胚率[41]。也有其他研究报道，玻璃化冷冻小鼠2细胞期胚胎可增加其卵裂期及囊胚期胚胎组蛋白H3K9乙酰化水平[42]。总体上来说，玻璃化冷冻卵母细胞、胚胎会促进卵母细胞和早期胚胎组蛋白乙酰化高水平表达，这与玻璃化冷冻导致HATs和HDACs之间的平衡异常以及早期胚胎基因组激活较少有关，但是否会导致囊胚期组蛋白乙酰化水平改变，还需扩大样本量深入研究。

组蛋白甲基化：组蛋白甲基化修饰主要发生在组蛋白的赖氨酸和精氨酸残基上，特定的组蛋白甲基化修饰可以调控早期胚胎的命运，并对维持胚胎多功能性起着重要作用。早期胚胎组蛋白低甲基化水平与胚胎异常形态有关[43]，有可能是胚胎发育不良的预测指标。H3K9甲基化水平在胚胎发育过程中非常重要，相对较高H3K9甲基化水平可提高囊胚形成率[24]。研究表明，玻璃化冷冻小鼠MⅡ期卵母细胞H3K9甲基化水平增高，继续体外培养至2细胞期及4细胞期胚胎，发现卵裂期胚胎H3K9甲基化水平降低，而胚胎继续发育至囊胚期，H3K9甲基化水平恢复至正常水平[43]。以此推测，卵母细胞玻璃化冷冻后发育成囊胚过程中，可能主动调整了卵母细胞及早期卵裂期胚胎的异常组蛋白甲基化水平，这些异常可以通过某些机制在早期卵裂期胚胎中得到部分纠正，胚胎最终发育到囊胚阶段。

五、结语

卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻及复苏技术已被广泛运用于各生殖中心，玻璃化冷冻技术相较于程序化冷冻不仅有着安全、经济、便捷的优势，还可提高胚胎的复苏率和利用率。动物实验提示，经玻璃化冷冻复苏的胚胎产生的子代其体重及脂肪含量增加，但是卵母细胞、胚胎玻璃化冷冻是否会对母婴结局有其他影响仍需加强后续子代的长期随访研究。目前研究结果表明，虽然卵母细胞和胚胎玻璃化冷冻不改变哺乳动物DNA序列，但可导致基因表观遗传修饰水平的变化进而影响其靶基因表达水平，包括DNA甲基化和组蛋白修饰等复杂且动态的改变。广泛、深入、系统地研究卵母细胞和胚胎经玻璃化冷冻后所造成的表观遗传学改变，可以为改善玻璃化冷冻卵母细胞及胚胎技术、了解玻璃化冷冻对妊娠结局及子代长远影响的机制提供理论依据。