张丹丹

(安徽三联学院 护理学院，安徽 合肥 230031)

皮下注射胰岛素是治疗糖尿病的传统方法，但其使用不便、副作用严重[1]，因而许多研究人员致力于从草药中寻找成本低、副作用小的治疗方法[2]。小花柳叶菜含有多种活性成分，如槲皮素等多酚和黄酮醇苷[3]等，这些成分能削弱环氧合酶1和环氧合酶2的作用，抑制大肠杆菌的生长，并发挥抗氧化活性，比传统的抗氧化剂如Trolox和抗坏血酸清除自由基的活性高，在前列腺增生、疼痛性和炎症性等疾病中发挥了很好的治疗作用[4-6]。本研究以患有2型糖尿病大鼠为对象，分析小花柳叶菜水提物抗高血糖和高血脂的药物机理，并评估其治疗2型糖尿病的价值。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

雄性白化Wistar大鼠，3月龄，体质量180 ～ 250 g，在环境温度(25±2) ℃和相对湿度(50±0.1)%条件下饲养，昼夜自由取水和进食。

1.1.2 高脂饲料

通过对Bigoniya等[7]提出的饮食组成进行改良，制备成高脂饲料。饲料中普通粉饲粮、山羊脂肪、椰子油、果糖、酪蛋白、鸡蛋蛋白、复合维生素和氯化钠的质量分数分别为40.0%、25.0%、6.0%、10.0%、6.0%、12.0%、0.5%和0.5%。

1.2 方法

1.2.1 高脂膳食果糖链脲佐菌素(HFD-FRU-STZ)诱导2型糖尿病

30只白化Wistar大鼠被平均分成5组。除正 常对照组的6只大鼠外，其余均用高脂饲料喂养2 w后禁食过夜；将小剂量新鲜制备的链脲佐菌素(质量分数为35 mg/kg)溶于0.1 mol/L柠檬酸钠缓冲液(pH=4.5)中[8]，再注射到大鼠的腹腔；1 w后观察大鼠空腹血糖(fasting blood sugar,FBS)，将FBS显示为250～350 mg/dL的大鼠选为实验用鼠。

1.2.2 药物治疗方案

正常对照组：不患有2型糖尿病的大鼠，饲喂正常饮食；糖尿病对照组：患有2型糖尿病的大鼠，饲喂HFD-FRU-STZ(蒸馏水为载体)；标准治疗组：患有2型糖尿病的大鼠，按10 mg/kg给予吡格列酮进行灌胃治疗，持续3 w；小剂量小花柳叶菜水提物(购自扶风斯诺特生物科技有限公司)治疗组：患有2型糖尿病的大鼠，按200 mg/kg给予小花柳叶菜水提物进行灌胃治疗，持续3 w；大剂量小花柳叶菜水提物治疗组：患有2型糖尿病的大鼠，按400 mg/kg给予小花柳叶菜水提物进行灌胃治疗，持续3 w。

1.2.3 数据采集

在第0、3、6 w测定大鼠的体质量，在第1、3、6 w测定摄食量和饮水量。给大鼠一定量的食物和水，24 h后从初始量中减去剩余量来确定消耗量。

3 w后，5组大鼠于夜间禁食后采用光醚诱导麻醉，将细毛细管轻轻插入眼球内角，从眶后神经丛采血约1.5 mL。采得的血液以4 000 r/min的转速离心10 min，取血清。采用半自动分析仪中的Coral工具通过比色法测定空腹血糖(FBS)、糖化血红蛋白(HbA1c)、血清谷草转氨酶(SGOT)、血清谷丙转氨酶(SGPT)、碱性磷酸酶(ALP)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)、尿酸、肌酸酐值；采用全自动分析仪(CAREX)中的Excel工具通过比浊法检测高敏C-反应蛋白(hs-CRP)；利用Elisa酶标仪检测肿瘤坏死因子(TNF-α)和胰岛素；通过“空腹胰岛素×FBS÷22.5”公式计算胰岛素抗性稳态模型评估(HOMA-IR)指数，以评估胰岛素抵抗程度[9]；6 w前进行2 d的口服葡萄糖耐量试验(OGTT)[10]。

1.3 统计学分析

实验结果用Mean SEM表示，用Graph pad Prism 5软件对数据进行分析。数据采用双因素方差分析(ANOVA)，并进行Bonferroni后测。采用Dunnett-t检验对胰岛素、HOMA-IR、肌酸酐、尿酸、脂质谱、肝脏谱等参数进行统计分析。P(显著特性)<0.05有统计学意义。

2 结果

经HFD-FRU-STZ喂养至第3 w时，各组大鼠的体质量、摄食量和饮水量较正常对照组均有所增加。相比第3 w，第6 w时糖尿病对照组的体质量显著下降，但摄食量和饮水量均有所增加；而与糖尿病对照组相比，治疗组的摄食量和饮水量减少，体质量增加。结果见表1和图1。

表1 不同时段大鼠食物和水的摄入量

由表2可知，与正常对照组相比，HFD-FRU-STZ饮食显著提高了糖尿病对照组大鼠的FBS、HbA1c和HOMA-IR指数，但显著降低了它们的血清胰岛素水平。相比糖尿病对照组，治疗组的FBS、HbA1c和HOMA-IR指数降低，血清胰岛素水平明显提高，证明小花柳叶菜水提物具有抗高血糖活性。而且，相比小剂量小花柳叶菜水提物治疗组，大剂量小花柳叶菜水提物治疗组的FBS、HbA1c和HOMA-IR指数均明显降低，血清胰岛素水平明显增高。

表2 大鼠空腹血糖的相关指标

在口服葡萄糖后的5个时间点，分别测定各组的血糖水平，结果见图2。由图2可知，正常对照组大鼠的血糖水平在60 min时达到较高水平，120 min时降至正常水平。在糖尿病对照组中，尽管在120 min时血糖大约下降到初始水平。对于接受吡格列酮和小花柳叶菜水提物治疗的大鼠，血糖水平在60 min时逐渐下降，在120 min时逐渐达到接近0 min时的值。在各时间点，小剂量小花柳叶菜水提物治疗组大鼠的血糖水平都低于大剂量小花柳叶菜水提物治疗组，说明小花柳叶菜水提物的治疗效果与剂量有相关性。

TNF-α和hs-CRP是糖尿病和肥胖的发病过程中的重要因子，可产生胰岛素抗性。由表3可知，与正常对照组相比，糖尿病对照组的TNF-α和hs-CRP均明显升高。用吡格列酮和小花柳叶菜水提物治疗可使其水平下降到接近正常值。与吡格列酮治疗组相比，小花柳叶菜水提物在降低TNF-α和hs-CRP方面的效果较差。糖尿病对照组中的肝酶指标(SGOT、SGPT、ALP)明显高于正常对照组。与糖尿病对照组相比，吡格列酮和小花柳叶菜水提物治疗组大鼠的肝酶指标明显降低，小花柳叶菜水提物治疗组的肝酶高于吡格列酮标准治疗组。糖尿病对照组大鼠的肾功能指标(血清肌酸酐和尿酸)水平较正常对照组均明显升高，而与糖尿病对照组相比，吡格列酮和小花柳叶菜水提物治疗组大鼠的肾功能指标均显著降低。糖尿病对照组的TG、TC、VLDL、LDL等脂质生物标志物显著升高，而HDL明显降低。与糖尿病对照组相比，吡格列酮和小花柳叶菜水提物的治疗使大鼠的血清TG、TC、VLDL、LDL水平显著降低，而HDL水平显著升高。

表3 第6 w指标数测量的结果

3 讨论

果糖诱导的动物2型糖尿病实验已取得了较多的研究成果[8-9]。富含果糖的饮食会损害葡萄糖的吸收，加快甘油三脂(TG)和胆固醇含量的升高，以此可模拟2型糖尿病的各种症状，如胰岛素抵抗增加、高脂血症、肾病、血压升高等。高果糖饮食可通过非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)诱导骨骼肌胰岛素抵抗，其机制是激活肠道中toll样受体4(tlr4)和核因子κB(NF κB)[10]。低剂量STZ和烟酰胺[11]、低剂量STZ加高脂肪饮食[12]和高果糖饮食[13]被许多研究者用来诱导与糖尿病相似的病理改变。本研究使用高脂膳食果糖链脲佐菌素(HFD-FRU-STZ)诱导表型代谢紊乱，引起碳水化合物和脂质代谢异常，诱发白化Wistar大鼠2型糖尿病的发生，并通过改变饮食习惯增加甘油三酯(TG)和胆固醇水平并导致外周组织胰岛素抵抗。

小花柳叶菜水提物对2型糖尿病的治疗作用首先体现在体质量改善上。2型糖尿病大鼠体质量的下降意味着利用肝脏葡萄糖异生肌肉蛋白来代偿胰岛素抵抗所导致的葡萄糖危机。用小花柳叶菜水提物治疗后，糖尿病大鼠的体质量有了实质性的改善，从而增加了胰岛素敏感性。另外，与糖尿病对照组相比，吡格列酮和小花柳叶菜水提物对糖尿病的治疗效果，可能源于其促胰岛素作用。果糖和血脂异常的慢性升高会增加活性氧和脂质过氧化，从而损伤组织的抗氧化系统，而氧化应激可以破坏胰腺细胞的线粒体，从而导致糖尿病的发生。这些变化主要体现在糖尿病对照组胰岛素分泌水平下降上。用吡格列酮和小花柳叶菜水提物治疗可以有效保护胰腺免受破坏。这种作用可能来自于酚、多酚基团的促进抗氧化防御机制。由于果糖喂食导致肝脏DNL过程发生，肝脏脂肪酸沉积增加，SGOT、SGPT和ALP产生增多，导致糖尿病对照组产生胰岛素抵抗。吡格列酮和小花柳叶菜水提物治疗组均通过显著降低上述酶活性而表现出肝保护作用。

同时，TG、TC、HDL、VLDL、LDL水平的测定结果显示，经过标准及试验药物治疗6 w后，大鼠的TG、TC、VLDL、LDL水平均有所改善，表明吡格列酮和小花柳叶菜水提物对2型糖尿病大鼠的降血脂作用显著。另外，与正常对照组相比，糖尿病对照组的血清TNF-α和高敏C反应蛋白(hs-CRP)等炎症生物标志物升高。TNF-α是一种炎症细胞因子，由脂肪组织单核巨噬细胞释放。TNF-α长期暴露可诱导体外和体内胰岛素抵抗。胰岛素抵抗是由于胰岛素受体的酪氨酸激酶受到抑制而产生的。TNF-α调节血浆游离脂肪酸水平，促进脂质合成。与糖尿病对照组相比，吡格列酮和小花柳叶菜水提物的治疗可降低TNF-α水平。400 mg/kg小花柳叶菜水提物治疗组的TNF-α水平的显著降低，表明其抗高血糖特性改善了胰岛素敏感性。C-反应蛋白(CRP)主要由肝细胞在细胞因子如白介素-6、白介素-1和TNF-α的控制下合成和释放。CRP是全身炎症的敏感标记物，与高血糖、胰岛素抵抗和明显的2型糖尿病(T2DM)有关。在本研究中，糖尿病对照组的hs-CRP因HFD-FRU-STZ而升高，因此，吡格列酮和小花柳叶菜水提物具有显著降低血清hs-CRP的抗炎作用。

最后，饮食中过量摄入嘌呤、高果糖玉米糖浆和蔗糖会产生更多的尿酸。高尿酸血症发生于肥胖、糖尿病和其他如高血压、肾病和高甘油三酯血症等情况[14]。肌酐水平升高可导致肾单位结构和功能的明显异常[15]。因此，测量血清尿酸水平和肌酸酐水平可以验证吡格列酮和小花柳叶菜水提物对肾功能是否有改善作用。

总之，HFD-FRU-STZ饮食可诱导动物糖尿病，通过多种细胞机制引起与2型糖尿病患者相似的共发病情况，该模型可以满足试验要求，比其他的基因型模型价格更低廉，为研究诱导2型糖尿病并发高脂血症提供了一种有效的低成本试验方法。而多项指标的评估结果表明，小花柳叶菜水提物可在一定程度上调节糖尿病人机体的抗氧化能力、胰岛素活性、糖和脂肪代谢以及肝肾功能，从而发挥一定的治疗作用。