郭亚瑞,郑贺予，冯秀艳,周伟强

(沈阳医学院 1.基础医学院病原生物学教研室、2.基础医学院临床医学班，辽宁 沈阳 110034；3.沈阳医学院附属第二医院内分泌科，辽宁 沈阳 110002)

近年来，组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor，HDACi)作为低毒、有效的抗肿瘤药物越来越受到人们的关注，西达苯胺(chidamide)是第三代口服型、针对组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)1、2、3和10亚型的苯胺类的HDACi[1]。西达苯胺通过表观遗传修饰影响乳腺癌细胞的生长[2]。长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)属于一类含有200多个核苷酸的非编码转录物，可以通过与DNA、RNA或蛋白质相互作用，在表观遗传学、转录及转录后水平调控基因的表达，参与多种病理生理过程[3-4]。因此，本研究旨在探讨特异LncRNA与靶蛋白互作对西达苯胺作用乳腺癌细胞的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器人乳腺癌细胞株MCF-7(ATCC细胞库)；RPMI 1640培养基、胎牛血清、青链霉素(Thermo Scientific)；西达苯胺(Chipscreen Biosciences Ltd)；Muse Count&Viability试剂盒(Merck Millipore)；抗体(Abcam Inc)；siRNA(广州锐博生物技术有限公司)；细胞分析仪(Premego)，PCR扩增仪(Eppendorf)，实时定量PCR仪(Life Technology)，多通道化学发光成像系统(以色列DNR)。

1.2 方法

1.2.1细胞培养 将人乳腺癌MCF-7细胞用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基(添加100 kU·L-1青霉素和100 mg·L-1链霉素)，在含有5%的CO2、37 ℃饱和湿度下培养。

1.2.2MTT法检测细胞存活率 MTT法检测不同浓度西达苯胺(0、20、100 μmol·L-1)作用后的细胞存活率。

1.2.3高通量测序筛选差异表达LncRNA分子 将西达苯胺与MCF-7细胞共同培养24 h，根据试剂盒说明提取样品的总RNA后，逆转录合成第一链cDNA，PCR扩增并纯化，然后再对文库进行质检，最后上机测序。之后联合生物信息学软件分析西达苯胺作用后差异表达的LncRNA及互作蛋白。

1.2.4Muse自动细胞分析仪检测细胞活力 根据Muse Count &Viability试剂盒使用说明进行细胞计数和活力检测。

1.2.5LncRNA ENST00000448869.1-siRNA和Nestin-siRNA分别转染MCF-7细胞 根据Lipofectamine 3000转染试剂使用说明，将LncRNA ENST00000448869.1-siRNA和Nestin-siRNA转染MCF-7细胞，培养24 h进行后续实验。

1.2.6全细胞RNA提取和Real-time PCR 按照RNA提取试剂盒说明提取全细胞RNA，第一条链cDNA合成后，应用SYBR Green方法，以GAPDH为内参进行Real-time PCR反应。每个样品设置3个复孔，mRNA相对表达量按照2-ΔΔCt法计算。引物序列见Tab 1。

Tab1 Sequence of primer(5′-3′)

1.2.7Western blot检测Nestin表达变化 西达苯胺与MCF-7细胞共同孵育24 h，收集细胞提取总蛋白，并用BCA法测定蛋白含量，电泳、转膜、抗体孵育后，经ECL化学发光，凝胶成像系统成像。

2 结果

2.1 西达苯胺对MCF-7细胞生长的影响低浓度(20 μmol·L-1)和高浓度(100 μmol·L-1)的西达苯胺作用时，490 nm吸光度都比对照组明显降低(P<0.01)。

2.2 西达苯胺对MCF-7细胞中LncRNA ENST00000448869.1和Nestin表达的影响高通量测序联合生物信息学软件分析，西达苯胺组中LncRNA分子 ENST00000448869.1比对照组高表达，并与Nestin存在蛋白互作关系。Real-time PCR结果显示，在20 μmol·L-1(P<0.05)和100 μmol·L-1(P<0.01)的西达苯胺组中ENST00000448869.1与Nestin的RNA水平明显增高。

2.3 LncRNA ENST00000448869.1 siRNA转染对MCF-7细胞的影响为了进一步明确特异LncRNA ENST00000448869.1和Nestin之间的作用，我们设计特异siRNA转染乳腺癌MCF-7细胞，Real-time PCR结果显示siRNA转染细胞后，LncRNA ENST00000448869.1的RNA水平比西达苯胺组明显降低(P<0.01)。Western blot结果显示，Nestin的蛋白水平也在siRNA转染后降低。Muse细胞分析仪检测细胞活力的结果表明，LncRNA ENST00000448869.1-siRNA转染乳腺癌细胞后，与西达苯胺共同孵育，活细胞比率为55.9%，与对照组的63.3%相比明显降低，与西达苯胺组70.1%相比也明显降低。

2.4 Nestin-siRNA转染对MCF-7细胞的影响为了进一步探讨Nestin是否反向作用LncRNA ENST00000448869.1，采取Nestin-siRNA转染乳腺癌MCF-7细胞。结果显示，Nestin被siRNA敲降后，其基因和蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)，而对LncRNA ENST00000448869.1的基因表达无明显影响。

3 讨论

西达苯胺对乳腺癌有明显的抑制作用，有研究表明，西达苯胺调节肿瘤细胞中p21waf1/cip1蛋白的表达，从而阻断细胞周期并诱导凋亡[5]。我们的实验表明西达苯胺可以降低MCF-7细胞活细胞比率。LncRNA已被确定为乳腺癌发育的关键组成部分，有研究表明LncRNA的失调通过不同的信号通路调节细胞增殖和凋亡，从而导致肿瘤发生、转移和化学耐药性[6]。我们通过高通量测序联合生物信息学软件，分析筛选出LncRNA分子ENST00000448869.1在西达苯胺作用MCF-7细胞后出现高表达，并与Nestin存在蛋白互作。我们的结果说明西达苯胺作用乳腺癌细胞后存在LncRNA ENST00000448869.1与Nestin互作，拮抗西达苯胺的作用，而Nestin不能反向作用LncRNA ENST00000448869.1的表达。

Nestin是第Ⅵ类中间丝蛋白(intermediate filament，IF)家族的成员，在癌细胞中的表达与肿瘤生长、侵袭和化疗抵抗等恶性表型相关[7]。Nestin是癌症干细胞表型相关的一种蛋白，Nestin的表达增高更能显示肿瘤原性，体现肿瘤的恶性程度。LncRNA ENST00000448869.1的高表达是乳腺癌细胞对抗西达苯胺的一种正常的生理反应。西达苯胺作用乳腺癌细胞后，由LncRNA ENST00000448869.1诱导的Nestin的表达增加，相当于乳腺癌细胞的耐药。在本实验中，LncRNA ENST00000448869.1的功能被siRNA静默后，导致Nestin的功能下降，最终导致乳腺癌细胞肿瘤原性和生长活力的降低，从而增强了西达苯胺的作用。此研究为进一步探索LncRNA ENST00000448869.1和Nestin在西达苯胺在乳腺癌中的作用机制奠定了基础，为更好的研究LncRNA ENST00000448869.1调控Nestin的表达在抵抗西达苯胺的耐药机制提供了坚实的实验依据。