刘 霞，李 强，陈 勇，赵淑娟，郭荣珍，史炳霞，陈巧力，南桂英，孟召霞，张 冉，张 静

舌癌是口腔颌面部常见的恶性肿瘤，有80%属于鳞状细胞癌，以舌前2/3部位常见；20%为腺癌，多位于舌根部。舌癌的转移与浸润是一个复杂的过程，可受多种基因调控[1]。有研究显示，在肿瘤细胞发生、发展过程中，细胞外基质发挥着重要的作用，骨桥蛋白(OPN)则是细胞外基质中的一种非胶原蛋白，能参与细胞免疫、信号传导、骨矿化、细胞黏附等过程[2]。富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(Pyk2)则是黏着斑激酶中的一员，可改变多种含SH2结构域的底物蛋白，使其磷酸化，对骨架重组、细胞黏附、离子通道激活等多种信号传导通路具有调节作用，可调控细胞活性、增殖及迁移能力，在肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用[3]。磷酸化的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(p-AKT)属于高度保守的蛋白激酶，能够调控细胞的增殖与分化[4]。OPN、Pyk2、p-AKT在多种恶性肿瘤的发生、发展过程中均发挥着重要的作用。基于此，本文分析OPN、Pyk2、p-AKT在舌鳞状细胞癌中的表达情况，分析三者与舌鳞状细胞癌患者临床病理特征之间的关系，以期为临床诊疗和预后评估提供新的参考标志物。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2018年2月—2020年2月沧州市中心医院诊治103例舌鳞状细胞癌组织(舌癌组)及距肿瘤边缘>0.5 cm的癌旁正常组织(对照组)，其中男69例，女34例；年龄45～79(60.11±2.34)岁；临床分期：Ⅰ～Ⅱ期58例，Ⅲ～Ⅳ期45例；病理分化程度：低-中分化41例，高分化62例；有淋巴结转移49例，无淋巴结转移54例。治疗方式：根治性手术66例，根治性手术+周围淋巴结清扫37例；术后放化疗：是69例，否34例。①纳入标准：均经术后病理检查证实为舌鳞状细胞癌；无其他恶性肿瘤；临床资料完整；患者及家属均签署知情同意书。②排除标准：存在血液系统或免疫系统疾病者；合并心、肝、肾等严重原发性疾病者；入组前行放化疗者。本研究经医院医学伦理委员会批准执行。

1.2方法

1.2.1OPN、Pyk2、p-AKT检测方法：OPN、Pyk2、p-AKT均应用免疫组织化学法检测，兔抗人OPN多克隆抗体和DAB显色剂试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)、兔抗人Pyk2单克隆抗体(美国vitrogen公司)、兔抗人p-AKT多克隆抗体(美国Santa Cruz Biotechnology公司)。①操作步骤：将组织石蜡切片脱蜡、水化后行枸橼酸溶液微波修复，使用3%过氧化氢溶液在室温封闭内源性过氧化物10 min，3%小牛血清蛋白、37 ℃封闭1 h。滴加OPN、Pyk2、p-AKT一抗，4 ℃过夜，PBS代替一抗作为阴性对照，已知阳性标本作为阳性对照。滴加辣根过氧化物酶标记的二抗IgG-HRP，在37 ℃封闭30 min，DAB使用重氮氨基苯显色2～5 min，以苏木素进行轻度衬染，随后进行水洗、脱水、使用中性树胶进行封片，以光学显微镜观察。②结果判读：Pyk2、p-AKT蛋白着色为粗细不均匀的棕黄色颗粒，定位于细胞质或细胞核内，记为Pyk2、p-AKT表达阳性。细胞质中出现明显的棕黄色颗粒记为OPN表达阳性。在高倍镜(×400)视野计数100个细胞中阳性表达细胞数，总共计数5个视野，取平均值。使用半定量积分法对结果进行判读：0分为无阳性细胞；1分为阳性细胞数≤25%；2分为阳性细胞数25%～50%，3分为阳性细胞数50%～75%，4分为阳性细胞数>75%。以细胞着色程度进行评分：细胞无着色记0分；细胞着色为淡黄色记1分；细胞着色为棕黄色记2分；细胞着色为棕褐色记3分。根据两项得分之和计算结果，得分<3分为阴性，≥3分则为阳性，得分越高，阳性表达越高。

1.2.2随访：在术后随访13个月了解患者预后情况，根据生存情况分为生存组和死亡组。

1.3观察指标 比较不同组织中OPN、Pyk2、p-AKT表达情况，分析OPN、Pyk2、p-AKT与舌鳞状细胞癌患者临床病理参数的关系，并分析影响舌鳞状细胞癌患者预后生存的危险因素。

2 结果

2.1不同组织中OPN、Pyk2、p-AKT表达情况 舌癌组OPN、Pyk2、p-AKT表达阳性率均明显高于对照组(P<0.01)。见表1。

表1 舌鳞状细胞癌和癌旁正常组织两组OPN、Pyk2、p-AKT表达情况[例(%)]

2.2OPN、Pyk2、p-AKT与舌鳞状细胞癌患者临床病理参数的关系 不同性别、年龄、肿瘤直径舌鳞状细胞癌患者OPN、Pyk2、p-AKT表达情况比较差异无统计学意义(P>0.05)。Ⅲ～Ⅳ期、高分化、有淋巴结转移舌鳞状细胞癌患者OPN、Pyk2、p-AKT表达阳性率分别高于Ⅰ～Ⅱ期、低-中分化、无淋巴结转移患者(P<0.05，P<0.01)。见表2。

表2 OPN、Pyk2、p-AKT与舌鳞状细胞癌患者临床病理参数的关系(例)

2.3单因素分析 随访13个月后，103例中生存81例(78.64%)，死亡22例(21.36%)。Ⅲ～Ⅳ期、高分化、有淋巴结转移及OPN、Pyk2、p-AKT表达阳性舌鳞状细胞癌患者病死率分别高于Ⅰ～Ⅱ期、低-中分化、无淋巴结转移及OPN、Pyk2、p-AKT表达阴性患者(P<0.05，P<0.01)。不同性别、年龄、肿瘤直径舌鳞状细胞癌患者的病死率比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

表3 影响舌鳞状细胞癌患者预后生存的单因素分析(例)

2.4多因素Logistic回归分析 将上述单因素分析中差异有统计学意义的影响因素纳入多因素Logistic回归分析，影响因素赋值：临床分期(Ⅰ～Ⅱ期=0，Ⅲ～Ⅳ期=1)、病理分化程度(低-中分化=0，高分化=1)、淋巴结转移(否=0，是=1)、OPN表达(阴性=0，阳性=1)、Pyk2表达(阴性=0，阳性=1)、p-AKT表达(阴性=0，阳性=1)。Ⅲ～Ⅳ期、高分化、有淋巴结转移以及OPN、Pyk2、p-AKT表达阳性是影响舌鳞状细胞癌患者预后生存的独立危险因素(P<0.01)。见表4。

表4 影响舌鳞状细胞癌患者预后生存的多因素Logistic回归分析

3 讨论

OPN是与恶性转化有关的磷酸化蛋白提取物，是骨骼、牙齿矿化细胞外基质的主要成分[5]。近年来有研究表明，在许多肿瘤中可发现OPN表达明显上调，而且OPN表达与肿瘤生物学行为及预后存在着密切的联系[6]。有研究显示，在大肠癌、胃癌、卵巢癌、食管癌等癌细胞中均发现OPN表达明显上调，且OPN表达与患者病理学分期存在一定的联系[7-8]。也有学者发现，OPN在乳腺癌中表达明显升高，而且OPN表达阳性患者的预后生存时间明显短于OPN表达阴性患者，提示OPN表达与患者预后存在显著相关性[9-10]。国外研究也发现，在多种上皮性恶性肿瘤组织中OPN表达明显高于周围正常组织，在患者外周血液中的含量也明显升高，可为肿瘤诊断与筛查提供参考[11]。本研究结果显示，舌鳞状细胞癌组织中OPN表达阳性率明显高于癌旁正常组织，其表达与临床分期、病理分化程度、淋巴结转移情况密切相关，说明OPN在舌癌发生、发展及淋巴结转移过程中发挥着重要作用。

Pyk2参与肿瘤细胞迁移、凋亡，在肿瘤发生、发展过程中的作用也逐渐凸显[12-13]。本研究发现，Pyk2主要表达于细胞质，在癌组织中阳性率高于癌旁正常组织。其他研究也发现，Pyk2在头颈部鳞癌、前列腺癌、非小细胞肺癌中表达也明显增加[14-15]。进一步研究发现，Pyk2表达与临床分期、病理分化程度、淋巴结转移情况显著相关，说明Pyk2可能参与了舌鳞状细胞癌的浸润和转移，与以往研究结果相符[16]。

AKT作为高度保守的蛋白激酶，在生理情况下处于低活性或失活状态，如受到某些因素刺激，可导致AKT磷酸化而被激活[17]。p-AKT对细胞增殖、分化等具有重要的调控作用，在口腔癌、直肠癌、食管癌等恶性肿瘤中呈高表达，且可衡量磷脂酰肌醇-3-激酶活性[18-19]。本研究发现，p-AKT表达在癌组织中明显升高，且随着恶性程度升高，其阳性程度越高，还与癌组织转移有关，与以往研究结果一致[20-21]，提示p-AKT参与舌鳞状细胞癌的发生与发展。另外本研究还发现，OPN、Pyk2、p-AKT表达阳性均为影响舌鳞状细胞癌患者预后生存的独立危险因素，三者表达阳性程度越高，患者病死率越高，提示OPN、Pyk2、p-AKT可能是反映舌鳞状细胞癌生物学行为和预后的重要标志物。如针对OPN、Pyk2、p-AKT作为靶点进行药物研发，或许可提高舌鳞状细胞癌患者的综合治疗效果[22]。

综上所述，OPN、Pyk2、p-AKT在舌鳞状细胞癌组织中表达均明显上调，在疾病的发生、发展过程中发挥着重要作用，且与癌细胞浸润、转移密切相关，还可为舌鳞状细胞癌预后评估提供参考。