赵浩余，冯 芮，周勤梅, 3，彭 成，刘昭华，朱 欢*，熊 亮*

山莨菪中1个新的降碳香根螺烷型倍半萜

赵浩余1, 2，冯 芮1, 2，周勤梅1, 2, 3，彭 成1，刘昭华4，朱 欢1, 2*，熊 亮1, 2*

1. 成都中医药大学药学院 西南特色中药资源国家重点实验室，四川 成都 611137 2. 成都中医药大学 西南特色药材创新药物成分研究所，四川 成都 611137 3. 成都中医药大学 中医药创新研究院，四川 成都 611137 4. 成都第一制药有限公司，四川 成都 610031

研究山莨菪的化学成分及其生物活性。采用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、制备薄层色谱和半制备高效液相色谱等方法进行分离纯化，运用多种现代波谱学手段对化合物进行结构鉴定，进一步通过X-ray单晶衍射分析和计算电子圆二色光谱（electronic circular dichroism，ECD）确定其绝对构型；采用CCK-8法测定化合物对人宫颈癌HeLa细胞、人胃癌HGC-27细胞和人肝癌HepG2细胞的细胞毒活性，采用Griess法测定化合物对脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）诱导小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7释放NO的影响。从山莨菪中分离得到1个新的降碳香根螺烷型倍半萜，鉴定为(2,5,6,7,8)-15-降-香根螺烷-9(10),11(12)-二烯-7,8,13-三醇（1）；活性评价显示化合物1无细胞毒和抗炎活性。化合物1为从山莨菪中发现的新化合物，命名为山莨菪醇E，其在香根螺烷型骨架的基础上，经氧化脱羧失去C-15而成为降碳倍半萜。

山莨菪；倍半萜；降碳香根螺烷型；山莨菪醇E；绝对构型

山莨菪(Maxim.) Pascher，又名藏茄、樟柳柽、唐传那保，为茄科（Solanaceae）山莨菪属多年生宿根草本。主要分布在我国青海、甘肃、西藏和四川西南部，生于海拔2800～4200 m的山坡、草坡向阳处[1-2]。其根可供药用，具有镇痛解痉、活血祛瘀、止血生肌的功效，可用于治疗跌打损伤、骨折、外伤出血、溃疡病、胃肠炎及胆石症等[3-4]。目前国内外学者对山莨菪化学成分的研究多集中于生物碱类，包括18个酰胺、14个托品烷、2个吡咯烷和1个亚精胺生物碱，并报道了此类成分具有拮抗乙酰胆碱受体、激动μ-阿片受体、抑制丁酰胆碱酯酶、抗氧化和镇痛等药理活性[5-12]，其中山莨菪碱、樟柳碱和红古豆碱等生物碱的相应制剂已作为上市药物广泛应用于临床。通过文献调研发现，山莨菪非生物碱类成分鲜有报道。课题组前期分离鉴定了4个具有新颖骨架的倍半萜类化合物[13]，为进一步丰富山莨菪化学成分的多样性，本研究利用多种色谱方法和波谱技术对山莨菪倍半萜类成分展开研究，得到1个新的降碳香根螺烷型倍半萜，命名为山莨菪醇E（anisotanol E，1），并对分离所得化合物进行细胞毒活性和抗炎活性评价。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Rudolph Autopol I自动旋光仪（美国Rudolph公司）；Applied Photophysics Chirascan圆二色光谱仪（英国Applied Photophysics公司）；Agilent Cary 600 FT-IR microscope光谱仪（美国Agilent公司）；Bruker D8 Quest单晶衍射仪（美国Bruker公司）；Bruker Avance NEO-600核磁共振波谱仪；Waters Synapt G2高分辨质谱仪（美国Waters公司）；BÜCHI M-565熔点测定仪（瑞士BÜCHI公司）；Agilent 1220高效液相色谱仪；Welch Ultimate XB-C18色谱柱（Welch公司，250 mm×10 mm，5 μm）；Sartorius分析天平（德国Sartorius公司）；SW-CJ-2F双人双面净化工作台（苏州净化设备有限公司）；MCO-15AC CO2细胞培养箱（日本SANYO公司）；Varioskan多功能酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 材料

Sephadex LH-20葡聚糖凝胶（40～70 μm，瑞典Amershan Pharmaci公司）；柱色谱硅胶（200～300目，烟台江友硅胶开发有限公司）；高效薄层色谱硅胶板（GF254硅胶，安徽良臣硅源材料有限公司）；制备薄层色谱硅胶板（GF254硅胶，安徽良臣硅源材料有限公司）；色谱纯甲醇（美国Sigma公司）；其余试剂均为分析纯（成都科隆化学品有限公司）；Gibco DMEM培养基（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Gibco胰蛋白酶；Biosharp PBS缓冲液（北京兰杰柯科技有限公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；CCK-8试剂盒（上海陶术生物科技有限公司，批号C0005）；脂多糖（lipopolysaccharides，LPS，美国Sigma公司，批号039M4004V）；一氧化氮检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号022421210712）。人宫颈癌HeLa细胞、人胃癌HGC-27细胞、人肝癌HepG2细胞和小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7均购自美国模式培养物集存库。

1.3 药材来源

山莨菪药材采于四川省阿坝藏族羌族自治州，经成都中医药大学高继海副教授鉴定为山莨菪(Maxim.) Pascher的干燥根，植物标本（AT-20171010）保存于成都第一制药有限公司。

2 方法与结果

2.1 提取与分离

山莨菪药材（500 kg）粉碎后加入8%氨水（250 L）润湿，用甲醛酯（3×103L）常温逆流提取2 h，浸提液加入20%硫酸调节pH至4.0，静置分层。酸水层用于纯化制备樟柳碱、山莨菪碱和红古豆碱等生物碱供药品生产；甲醛酯层减压浓缩后得到非生物碱浸膏（3 kg）。将部分浸膏（1 kg）分散于水中，依次用石油醚、醋酸乙酯和正丁醇萃取，回收溶剂得到石油醚浸膏（800 g）、醋酸乙酯浸膏（60 g）和正丁醇浸膏（60 g）。将醋酸乙酯萃取物（60 g）用硅胶柱色谱分离，以石油醚-醋酸乙酯（50∶1～1∶1）和醋酸乙酯-甲醇（1∶0～0∶1）梯度洗脱得到9个洗脱部分（Fr. 1～9）。其中，Fr. 7（17.9 g）经Sephadex LH-20凝胶柱色谱，以石油醚-二氯甲烷-甲醇（5∶5∶1）洗脱，得到12个流分（Fr. 7-1～7-12）。随后，将Fr. 7-12（500 mg）用硅胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇（100∶1～10∶1）梯度洗脱得到5个洗脱部分（Fr. 7-12-1～7-12-5）。Fr. 7-12-4（30 mg）依次经制备薄层色谱［二氯甲烷-丙酮（3∶1）］和反相高效液相色谱（40%甲醇水溶液）分离得到化合物1（5 mg，R＝68.5 min，1.5 mL/min）。

2.2 结构鉴定

化合物1：无色片状结晶（甲醇），mp 104～109 ℃。HR-ESI-MS给出准分子离子峰/261.146 7 [M＋Na]+（计算值C14H22O3Na, 261.146 7），推测其分子式为C14H22O3，不饱和度为4。−5.0° (0.04, MeOH)；ECD (MeCN) 193 (Δ−31.13) nm；(cm−1): 3434, 2924, 2854, 1647, 1466, 1384, 1261, 1027, 897, 801。13C-NMR (150 MHz, acetone-6) 和DEPT谱显示该化合物共有14个碳信号（表1），可归属为1×CH3、5×CH2[包含1个连氧亚甲基(C65.3) 和1个烯碳(C106.5)]、6×CH [包含2个连氧次甲基(C76.8, 74.8) 和2个烯碳(C140.5, 125.9)] 和2个季碳[包含1个烯碳(C153.7)] 信号。1H-NMR (600 MHz, acetone-6) 和HSQC谱显示了与上述CH3、CH2和CH对应的质子信号，此外还显示出3个活泼氢信号[H3.83 (1H, brs), 3.77 (1H, t,= 5.4 Hz), 3.71 (1H, brs)]（表1）。在1H-1H COSY谱中可观察到2组自旋偶合体系：-CH2CHCH2CH2-和-CH(CH3)CHCHCH=CH−（图1），结合HMBC谱中H2-1和H2-4同时与C-5、C-6、C-10相关，H-6和H-10同时与C-5相关，H2-1和H2-3与C-11相关，H2-12与C-2、C-11、C-13相关（图1），推测化合物1为1个降碳的香根螺烷型倍半萜。通过1H-1H COSY相关信号H-7/OH-7、H-8/OH-8和H2-13/OH-13，以及HMBC谱中OH-13与C-11和C-13相关信号，确定3个羟基分别取代于C-7、C-8和C-13位。

化合物1的相对构型通过NOESY谱和偶合常数确定。NOESY谱中H-2与H3-14相关，H-6与H-8相关以及H-7与H2-4和H3-14相关，表明H-2，H2-4，H-7和H3-14位于同侧，而与H-6和H-8位于异侧（图1）。较大的偶合常数(6, 7= 10.2 Hz和7, 8= 8.4 Hz) 也说明了H-6和H-7，H-7和H-8位于相反的一侧。同时该化合物的单晶测定结果验证了上述相对构型（图2）。进一步通过对比实验ECD和计算ECD确定化合物1的绝对构型。如图2所示，在190～260 nm内，理论计算的(2,5,6,7,8)- 1 ECD谱与实测的ECD谱吻合。因此，化合物1的绝对构型确定为2,5,6,7,8，化合物1的结构鉴定为(2,5,6,7,8)-15-降-香根螺烷-9(10), 11(12)-二烯-7,8,13-三醇。

表1 化合物1的1H-NMR及13C-NMR数据(600/150 MHz, acetone-d6)

Table 1 1H-NMR and 13C-NMR data for compound 1 (600/150 MHz, acetone-d6)

碳位δHδC 11.91 (1H, dd, J = 13.2, 9.0 Hz)1.49 (1H, dd, J = 13.2, 10.2 Hz)45.2 22.58 (1H, m)44.5 31.83 (1H, overlapped), 1.63 (1H, m)32.3 41.87 (1H, overlapped) 1.41 (1H, ddd, J = 12.6, 7.2, 1.2 Hz)34.5 5—48.7 61.72 (1H, dq, J = 10.2, 6.6 Hz)43.9 73.21 (1H, dd, J = 10.2, 8.4 Hz)76.8 83.90 (1H, brd, J = 8.4 Hz)74.8 95.32 (1H, dd, J = 10.2, 1.8 Hz)125.9 105.63 (1H, dd, J = 10.2, 1.8 Hz)140.5 11—153.7 125.02 (1H, s), 4.85 (1H, s)106.5 134.05 (2H, d, J = 5.4 Hz)65.3 141.03 (3H, d, J = 6.6 Hz)12.0 7-OH3.71 (1H, brs) 8-OH3.83 (1H, brs) 13-OH3.77 (1H, t, J = 5.4 Hz)

化合物1的X-ray单晶衍射数据：C14H22O3，＝238，单斜晶系（monoclinic），＝0.980 06(9) nm，＝0.654 91(5) nm，＝1.101 51(8) nm，＝90°，＝109.890(5)°，＝90°，＝0.664 83(9) nm3，space group21，＝293(2) K，＝2，(Cu K)＝0.657 mm-1。收集6097次单晶反射数据（reflections collected），其中2297个可用数据（independent reflections），int＝0.080 2，1＝0.055 0 [＞2()]，2＝0.123 4 [＞2()]，1＝0.098 9 (all data)，2＝0.148 6 (all data)，2＝1.002，Flack parameter＝−0.3(4)。CCDC：2 113 414。

2.3 药理活性研究

2.3.1 细胞毒活性筛选 采用CCK-8法测定化合物1体外抑制HeLa细胞、HGC-27细胞和HepG2细胞增殖活性[14]。取对数生长期的HeLa/HGC-27/ HepG2细胞，以4000个/孔接种于96孔板上并孵育24 h，空白组加入不含药物的培养基，药物组加入浓度为3.13、6.25、12.5、25和50 μmol/L的受试化合物，每个浓度设4个复孔。培养48 h后，每孔加入10 μL CCK-8，在37 ℃下孵育1 h后，使用酶标仪在450 nm处测定吸光度并计算细胞存活率。结果表明，化合物1对3种人类肿瘤细胞系HeLa、HGC-27和HepG2细胞未表现出细胞毒活性。

图1 化合物1的结构及主要HMBC、1H-1H COSY和NOESY信号

图2 化合物1的X-ray单晶衍射结构(左)和ECD谱(右)

2.3.2 NO抑制活性测定 采用Griess法评价化合物1抑制RAW 264.7细胞释放NO的作用[15]。取对数生长期的RAW 264.7细胞，以5×104个/孔接种于96孔板上并孵育24 h，空白组加入不含药物的培养基，模型组加入1 μg/mL LPS，药物组加入浓度为3.13、6.25、12.5、25和50 μmol/L的受试化合物，每个浓度设立4个复孔。培养48 h后，按照试剂盒说明检测细胞上清液中NO水平。结果表明，化合物1对LPS诱导RAW 264.7细胞释放NO无抑制作用。

3 讨论

山莨菪含有大量生物碱类成分，而非生物碱类成分鲜有研究，除课题组前期分离得到的4个山莨菪烷型倍半萜外[13]，仅2个香豆素苷被报道[16]。本研究采用多种色谱分离方法从山莨菪中获得1个新的降碳香根螺烷型倍半萜（1），并通过X-ray单晶衍射法和ECD计算确定其绝对构型。香根螺烷型倍半萜多报道于茄科和菊科植物，目前共分离鉴定60余个，其中降碳倍半萜较为少见[17-19]。本论文首次从茄科植物山莨菪中发现香根螺烷型倍半萜，其在香根螺烷型骨架的基础上，经氧化脱羧失去C-15而成为降碳倍半萜。药理研究表明此类倍半萜具有显著的抗肿瘤、抗炎、抗真菌和保肝活性[19-21]。本论文研究发现化合物1对3种人类肿瘤细胞系HeLa、HGC-27和HepG2细胞未表现出细胞毒活性，对LPS诱导RAW 264.7细胞释放NO无抑制作用。结合文献研究，推测8-酮羰基可能是决定香根螺烷型倍半萜发挥细胞毒和抗炎活性的重要结构[19,22-23]。此外，六元环上羟基的引入可能会显著降低这种细胞毒和抗炎作用[24]。综上所述，本研究丰富了山莨菪的化学成分类型，为山莨菪倍半萜类成分的后续研究提供参考。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突

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A novel-vetispirane sesquiterpenoid from

ZHAO Hao-yu1, 2, FENG Rui1, 2, ZHOU Qin-mei1, 2, 3, PENG Cheng1, LIU Zhao-hua4, ZHU Huan1, 2, XIONG Liang1, 2

1. State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 2. Institute of Innovative Medicine Ingredients of Southwest Specialty Medicinal Materials, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 3. Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 611137, China 4. Chengdu No.1 Pharmaceutical Co., Ltd., Chengdu 610031, China

To study the chemical constituents and bioactivities of.The compounds were separated and purified by silica gel, Sephadex LH-20 column chromatography, preparative TLC, and semi-preparative HPLC. The structures were determined by comprehensive spectroscopic techniques, and the absolute configuration was confirmed via single-crystal X-ray diffraction analysis and electronic circular dichroism (ECD) calculation. Furthermore, CCK-8 assay and Griess assay were used to evaluate the cytotoxic of the compounds against HeLa cells, HGC-27 cells, and HepG2 cells, and the effect of the compound on lipopolysaccharide (LPS)-induced nitric oxide (NO) production in RAW 264.7 cells, respectively.A novel-vetispirane sesquiterpenoid was isolated from, which was determined to be (2,5,6,7,8)-15-- vetispirane-9(10),11(12)-dien-7,8,13-triol (1). It showed no cytotoxic and anti-inflammatory activities.Compound 1 was a new sesquiterpenoid obtained from, named anisotanol E. It lost C-15 after oxidation and decarboxylation on the vetispirane skeleton.

(Maxim.) Pascher;sesquiterpenoid;-vetispirane; anisotanol E; absolute configuration

R284.1

A

0253 - 2670(2022)04 - 0973 - 05

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.04.002

2021-11-06

国家自然科学基金优秀青年科学基金（82022072）；霍英东基金（171037）；四川省科技计划重点研发项目（2018JZ0081）；成都中医药大学“杏林学者”学科人才科研提升计划（YXRC2018005）；成都中医药大学西南特色中药资源重点实验室开放研究基金资助项目（2020XSGG015）

赵浩余，硕士研究生，研究方向为中药药效物质基础研究。Tel: 18408288129 E-mail: zhaohaoyucn@163.com

熊 亮，博士，博士生导师，研究员，研究方向为中药药效物质及开发应用研究。Tel: (028)61800231 E-mail: xiling@cdutcm.edu.cn

朱 欢，硕士，研究方向为中药药效物质基础研究。Tel: 18482134471 E-mail: 18482134471@163.com

[责任编辑 王文倩]