彭鸿碧，贾 婷，王政昆，朱万龙

(1.云南省高校西南山地生态系统动植物生态适应进化及保护重点实验室，云南师范大学生命科学学院，昆明 650500; 2.云南经济管理学院，昆明 650106)

环境光及其物理特性是影响动物大脑功能和认知的主要因子[1]。光照强度可以调节动物的空间学习记忆能力[2]，也可以对动物的行为和生理产生广泛的影响[3]。光可以通过调节睡眠和昼夜节律来调节行为和学习记忆能力(间接途径)，也可以直接影响行为和认知功能，而不会扰乱睡眠或造成昼夜节律失常(直接途径)，从而影响动物的体重和摄食量[4]。视网膜是哺乳动物唯一的感光器官，光直接投射到参与行为反应的大脑区域，其中包括杏仁核、纹状床核和导水管周围灰质[5]。已知其中一些区域的活动是光以波长依赖的方式剧烈调节的[6]。异常的光照会导致动物体学习记忆能力下降[7]。

氧化剂和抗氧化剂之间的平衡向氧化剂转移的转变被称为氧化应激[8]。研究氧化应激最常用的生物标记物是丙二醛(Malondialdehyde，MDA)浓度、超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)浓度和活性的测定。MDA是主要的脂质过氧化产物，可与蛋白质、磷脂和核酸的游离氨基反应并引起其结构修饰，MDA具有细胞毒性，其浓度水平升高会加剧膜的损伤，从而降低动物体学习记忆水平[8]。SOD是生物体内已知的最有效的抗氧化剂之一，是细胞抵御氧化应激的重要组成部分，SOD能清除具有毒性而损坏细胞的超氧阴离子自由基，提高动物体学习记忆能力[9]。乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase，AChE)是生物神经传导的关键酶，通过升高动物体内AChE活性，从而降低ACh水平，可以改善动物体的学习记忆能力。一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase，NOS)主要参与脑的发育、学习和记忆过程。有研究表明，激活大鼠海马区NOS活性，从而提高动物体学习记忆水平[10]。

中缅树鼩(Tupaiabelangeri)属攀鼩目(Scandentia)树鼩科(Tupaiidae)，分布于南亚、东南亚以及中国南部和西南部地区[11]。因其在生物学特征及生理生化等方面与人类较为相近，已被用作非人灵长类动物的替代模型广泛应用于生物医学研究[12]。光照包括光周期、光照强度、波长和光源等4个特性，迄今为止，大多数研究都集中在光周期的影响[13]。在动物研究中，也有越来越多的证据表明强光照可以影响动物的认知[14]，然而很少有研究探讨光照强度变化对动物行为、学习记忆和氧化应激的影响。本实验旨在探讨不同光照强度是如何影响中缅树鼩学习记忆能力以及行为，从而为进一步研究不同强度光照影响中缅树鼩学习和记忆的基本机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集及分组

中缅树鼩均采自昆明市禄劝县，共计24只成年非繁殖个体(143±2.2)g，捕捉后于云南师范大学动物饲养房室内单笼饲喂，在室温为25 ℃±1 ℃、光(628)8 h/暗16 h循环、动物自由取食条件下驯化1个月后，将试验动物随机分为3组：628、1 256和2 512 lx光照组，每组8只。分别将628、1 256和2 512 lx的白炽灯(散发白光)悬挂于距竞技场观察箱上方120 cm处，每天9:00—17:00给予光照刺激，持续28 d。每天测定中缅树鼩的体重和摄食量。

1.2 方法

1.2.1 行为的测定

参考侯东敏等[15]对中缅树鼩行为的研究，本实验测定以下4种主要行为：活动行为(主要以跑步、爬行、跳跃、攀援、空翻和转圈等活动为主)；休息行为(静卧或静坐，睡姿主要以蜷缩睡眠、伸头睡眠和低头睡眠为主)；修饰行为(通过牙、口清洗足、脸、四肢和梳理被毛等)；取食行为(摄食、饮水、咀嚼、吞咽和舔吮等，取食姿势主要以坐式、捧式、蹲式、立式和卧式为主)。将每组试验动物分别置于竞技场观察箱(图1)，竞技场观察箱为3个相邻的独立饲养箱(规格为400 mm×400 mm×450 mm，材质为透明亚克力板和不透明亚克力板)构成，并装有实时监控摄像头，竞技场观察箱上方120 cm处装有不同瓦数的白炽灯用以行为观察时的照明[15]。

图1 竞技场观察箱示意图

对每只中缅树鼩的行为监测28 d，并对1、4、7、10、13、16、19、22、25和28 d所监测的行为状态进行观察记录，选取1 min为一个有效单位，将1 min内所观测到的持续时间最长的行为定义为有效行为，并统计各行为发生的频次。目标行为发生频次=(目标行为在监测时间段内所观测到的总数/监测时间段内所观测行为的总数)×100%。每天监测结束后，用75%酒精和清水清洗竞技场观察箱内壁，风干用于下次监测。

1.2.2 记忆能力的测定

Y-迷宫是由起始臂、安全区臂和危险区臂组成的，一种应用于研究动物空间记忆的迷宫模型，一般用于动物的学习和记忆能力的测定。开始测试时，中缅树鼩受到刺激可能会进入危险区，并在光照刺激作用下最终才跑至安全区(被动回避反应)，因此会出现错误反应，而在多次训练后，中缅树鼩会立即进入安全区，即形成明暗辨别条件反射[16]。本试验Y-型迷宫由底面及两侧面的镀锡铁皮(厚1.6 cm)制作，顶面端由透明亚克力板构成(图2)。Y-迷宫由适应箱(40 cm×30 cm×30 cm)、公共臂(70 cm×30 cm×30 cm)、选择臂(60 cm×30 cm×30 cm)、刺激源箱(40 cm×30 cm×30 cm)和空气泵(平均风速：38 L/min)组成[17]。刺激源箱由安全箱与危险箱组成，危险箱内装有不同瓦数的白炽灯(628、1 256和2 512 lx)，用作危险区；安全箱内装有规格为(18 cm×8 cm×8 cm)的暗盒，用作安全区。测试(3 d一测)时，将不同强度的光照刺激后的中缅树鼩置于Y-型迷宫起始臂中适应3～5 min，用木棍轻敲起始臂顶面端亚克力板，使中缅树鼩到达安全区，以连续10次中有9次或以上正确反应(正确反应率≥90%)定为学会标准[18]。正确反应率表示中缅树鼩空间反应的学习记忆能力[19]。每次测试结束后，用75%酒精和清水清洗Y-型迷宫内壁，风干用于下次测试。

图2 Y-迷宫示意图

1.2.3 脑组织不同物质含量和活性测定

不同强度的光照刺激28 d后，处死中缅树鼩，迅速剥离脑组织，并用4 ℃预冷的生理盐水洗尽残余血液，用吸水纸吸干水分，其后用PBS缓冲液(pH 7.4)研磨成10%的组织匀浆，将组织匀浆在3 000 r/min、4 ℃下离心10 min，收集上清液，并根据MDA、SOD、AChE和NOS的ELISA试剂盒的操作说明测定其浓度水平，根据SOD、AChE和NOS的ELISA试剂盒的操作说明测定其活性。

1.3 统计分析

应用SPSS 20.0软件进行统计学分析，对数据分布进行正态分布检验和方差齐性检验。体重、摄食量采用重复测量方差分析(Repeated Measurement ANOVA)；行为、记忆能力和脑组织不同物质含量和活性变化采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)和独立样本t检验。试验数据以平均值±标准误表示，以P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 体重和摄食量

驯化1～28 d，628 lx光照组中缅树鼩的体重变化差异不显著(F=0.28，P>0.05)，但是1 256和2 512 lx光照强度对中缅树鼩体重影响差异显著(1 256 lx：F=1.67，P<0.05；2 512 lx：F=1.64，P<0.05)。第28天，3组之间体重差异显著(F=4.16，P<0.05)，其中2 512 lx条件下中缅树鼩体重较低(图3)。不同光照强度对中缅树鼩的摄食量有影响，高的光照强度会降低中缅树鼩的摄食量。第28天，3组之间摄食量差异显著(F=5.07，P<0.05)，其中2 512 lx条件下中缅树鼩摄食量较低(图4)。

图3 不同光照强度对中缅树鼩体重的影响

图4 不同光照强度对中缅树鼩摄食量的影响

2.2 行为和记忆能力

增加光照强度会明显降低中缅树鼩的取食行为，增加休息行为，但是对修饰行为和活动行为的影响不显著。第28天，2 512 lx组中缅树鼩的取食行为显著降低，休息行为显著增加(取食行为：F=2.35，P<0.05；休息行为：F=3.02，P<0.05，图5)。驯化1～28 d，相同光照组中缅树鼩的识别正确率差异不显著，但强光照会降低中缅树鼩的识别的正确率，第28天时，3组之间识别正确率差异极显著(F=10.05，P<0.01，图6)。

图5 不同光照强度对中缅树鼩行为的影响

图6 不同光照强度对中缅树鼩正确反应率的影响

2.3 脑组织不同物质含量和活性

光照强度对MDA浓度影响差异极显著(F=46.04，P<0.01)，见图7(a)，其中2 512 lx光照组其浓度最高；628 lx组浓度最低。光照强度对SOD的浓度影响极显著(F=22.14，P<0.01)见图7(b)，其中2 512 lx组SOD浓度最低；628 lx组浓度最高，但是光照强度对NOS和AChE浓度没有影响[P>0.05，图7(c)和(d)]。光照强度对SOD活性影响极显著(F=28.15，P<0.01)，见图8(a)，对NOS和AChE活性影响极显著(NOS：F=42.83，P<0.01；AChE：F=36.16，P<0.01)，见图8(b)和(c)。

图7 不同光照强度对中缅树鼩脑组织中MDA、SOD、AChE和NOS浓度的影响

图8 不同光照强度对中缅树鼩脑组织中SOD、AChE和NOS活性的影响

3 讨论与结论

光照强度可影响小型哺乳动物的生长和发育[1]。本研究结果表明，在1 256 lx和2 512 lx的刺激条件下中缅树鼩体重明显低于628光照组，其中在2 512 lx条件下中缅树鼩体重最低，这可能与强光照导致中缅树鼩摄食量下降有关，最终影响中缅树鼩的生长发育。

光照强度可以调节大脑对认知任务的反应，然后调节皮层区域的活动，最终影响动物的行为[20]。本研究中，强光照会明显降低中缅树鼩的取食行为，增加休息行为。强光照条件下取食行为的降低应该是对强光照强度的适应[21]，同时，中缅树鼩会增加休息行为来减少不必要的能量消耗[22-23]。强光照条件下动物的行为变化与其情绪有关[24]，长期强光照刺激会诱发动物情绪消极，导致取食行为降低，休息行为增加[25]。光照同样可以影响动物的学习记忆[26]。第28天时，与628 lx组相比，1 256 lx组中缅树鼩识别的正确反应率较低，而2 512 lx组最低，说明强光照条件刺激会降低中缅树鼩识别的正确率，提示其学习记忆能力下降，这说明强光照可能会影响中缅树鼩的昼夜节律和睡眠，并影响其学习记忆能力[27-28]。

研究氧化损伤和氧化应激最常用的生物标记物是MDA浓度、SOD活性和SOD浓度的测定[10]。本研究中，高强度的光照刺激导致中缅树鼩学习记忆能力显著下降，这可能和中缅树鼩脑组织中MDA浓度水平升高有关[8]，表明在高强度的光照条件刺激下中缅树鼩脂质过氧化作用增加[29]。过度氧化应激以及过氧化损伤与脑部机能障碍、认知能力下降、空间学习和记忆减弱有关[9]。强光照组中缅树鼩SOD浓度水平显著下降，SOD活性显著升高，这可能与中缅树鼩脑组织中发生氧化损伤[30]和氧化应激[31]有关。此外，强光照组中缅树鼩脑组织中NOS和AChE活性显著降低。NOS活性下降则可能导致NO含量下降，从而降低中缅树鼩的学习记忆水平[32]。AChE活性的显著下降可能会导致突触裂隙中乙酰胆碱的减少，从而导致胆碱能活性的下降，进而导致中缅树鼩记忆能力下降[33]。

综上所述，强光照会降低中缅树鼩的体重和取食行为，增加休息行为，诱发中缅树鼩认知障碍，还会导致中缅树鼩脑内氧化应激水平增加和出现不同程度的氧化损伤。