代安娜, 张丽媛,2, 钱丽丽,2

(黑龙江八一农垦大学食品学院1，大庆 163319) (黑龙江省农产品加工与质量安全重点实验室2，大庆 163319)

玉米作为我国三大主粮之一，在收储过程易受到曲霉属和青霉属的侵染而产生霉变[1，2]。粮食在储藏过程中的霉变程度与含水率、温度和湿度密切相关[3，4]。此外在粮食储运过程中，添加防霉剂是防止霉变的有效手段之一，常用防霉剂是臭氧、磷化铝熏蒸及有机酸，但有化学毒性残留；造成环境二次污染和易使粮食中真菌产生抗性的缺点[5]。

植物精油(EOs)是从植物花、叶、果实等部位提取的植物次生代谢产物[6]。一般由醇类、酸类和酚类组成，作用机理复杂，难使病原菌产生抗性[7，8]，可作为一种天然提取物防腐剂[9，10]。目前开发利用的约300余种[11，12]，Prakash等[13]发现葛缕子精油可显著减少黄曲霉毒素的产生。Prieto等[14]发现万寿菊精油和百里香精油可有效抑制马铃薯赤霉病[14]，Ghabraie等[15]发现32种精油对4种致病菌和铜绿假单胞菌具有良好的抗菌活性[15]。此外也有研究表明黄曲霉、灰绿曲霉及青霉对丁香精油属于高度敏感[16]，黑曲霉对八角茴香精油属于中度敏感，对薄荷精油属于低度敏感[17，18]。此外有研究将肉桂、花椒、八角茴香精油复配发现能有效抑制从红提葡萄中分离的青霉菌、黑根霉及黑曲霉菌的生长[19]。此外将肉桂醛、柠檬醛、丁香酚和薄荷醇复合应用在玉米储藏上，可有效抑制黄曲霉生长，同时该精油复合物对霉菌抑制率(89%)，大于丙酸处理组(71.7%)[5]。而陈光勇等[20]将肉桂醛和百里香酚复合后对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果优于山梨酸、苯甲酸、柠檬酸、丁酸钠和丁酸甘油酯[20]。此外，与有机酸和丁酸类物质相比，植物精油主要从天然植物的活性部位提取，来源天然，具有无毒、较强的抑菌性和环境友好的优点，在抑制霉菌生长及毒素产生方面效果理想，是潜在用于玉米防霉，达到防止其霉变的有效物质。而目前大多是研究单种植物精油抑制果蔬霉菌和致病菌，肉制品细菌生长和玉米及稻谷中某些霉菌生长，很少研制复合植物精油防止玉米及储粮发生霉变。因此本实验选择6种植物精油，研究对玉米中分离的霉菌的抑制作用，为开发一种天然储粮防霉剂，减少经济损失和保护消费者健康等方面提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

精油：薄荷精油、丁香精油、八角茴香精油、花椒精油、大蒜精油、橙皮精油。

干玉米粒、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)、孟加拉红培养基、氯化镁(分析纯)、硝酸钠(分析纯)、丙酸(分析纯)。

1.2 仪器与设备

LDZM-802KCS立式高压蒸汽灭菌器，MJP-80型霉菌培养箱，SCB-1360型超净工作台，DGG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱，THZ-82A水浴恒温振荡器。

1.3 方法

1.3.1 分离鉴定霉菌

1.3.1.1 玉米培养基及饱和盐溶液

玉米培养基：采用含水量为20%和50%，称取25 g干玉米粒平铺到平皿，于121 ℃高压灭菌15 min，向上述平皿内加入1.3倍理论添加水量的灭菌蒸馏水，并于4 ℃冰箱内放置2 d(每隔6 h摇动1次)，以便充分吸湿后达到平衡水分含量[21]。

饱和盐溶液：无菌操作下向烧杯加入100 mL灭菌去离子水，并分别加入适量氯化镁和硝酸钠以形成实验所需的相对湿度为30%和70%的环境，将烧杯用保鲜膜密封后，并在下一步实验所需温度的恒温培养箱中放置2 d。

从冰箱中取出按上述操作制备好的不同水分含量的玉米培养基平皿，将平皿置于含有饱和盐溶液的烧杯内，每个烧杯中放置1个含玉米培养基的平皿，并将烧杯用保鲜膜密封后，分别于30 ℃和35 ℃条件下储藏，并分别对储藏2、4、6、8、10 d的玉米培养基中的优势霉菌进行分离培养。

1.3.1.2 霉菌分离和鉴定

无菌条件下，将按1.3.1.1步骤储藏的玉米培养基放入装有无菌水的锥形瓶中，振荡20 min，进行梯度稀释至合适浓度，取1 mL稀释样品到PDA培养基上，无菌涂布棒涂布均匀，28 ℃培养3～5 d，接种针挑取疑似霉菌菌落，在孟加拉红培养基上做划线分离，28 ℃纯种培养3代以上后，接种于PDA培养基内，于某公司鉴定菌株。

1.3.2 制备孢悬液

挑取纯种培养三代以上的的霉菌菌落，28 ℃培养72 h，平皿内加少许灭菌水，无菌涂布棒刮取孢子，灭菌水进行10倍稀释，并用血球计数板计数，制成浓度为3.0～6.0×106CFU/mL的孢悬液。

1.3.3 体外抑菌实验

采用滤纸片法测定植物精油的体外抑菌活性[22]。在超净工作台中向灭菌干燥后的培养皿(直径90 mm)中倒入约20 mL PDA培养基，待冷却凝固。吸取100 μL孢悬液到培养基表面，无菌涂布棒涂布均匀。

选用吸水性强的定性滤纸，用打孔器制作成小圆片(直径6 mm)，121 ℃高压灭菌烘干后，吸取10 μL精油滴加到干燥后的滤纸片上，用无菌镊子将滤纸片贴在培养基上压紧，每个培养皿上贴3片滤纸片做平行实验(3片滤纸片呈三角状排列且相距一定的距离)，重复3次实验，同时以不做处理的空白培养基为对照，丙酸处理的培养基作为对照组，28 ℃培养72 h，测量抑菌圈的直径，取3次结果平均值记录数据。根据抑菌圈直径的大小来判断结果[23]，抑菌圈>15 mm为高度敏感，10 mm<抑菌圈<15 mm时为中度敏感，7 mm<抑菌圈<9 mm时为低度敏感，抑菌圈=0 mm为不敏感。

根据单种精油抑菌实验及后续的最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的实验结果，选择综合抑菌效果好的四种精油进行复合，并吸取10 μL复合精油滴加到干燥后的滤纸片上后，在培养皿的中央放置1片滤纸片，其他操作步骤相同，28 ℃培养72 h，测量抑菌圈的直径，重复3次实验。

1.3.4 最小抑菌浓度(MIC)的测定

根据单种精油抑菌实验结果，选择5株霉菌表现为高度敏感的精油利用含毒介质法进行MIC和MBC的测定[24，25]。将精油用95%乙醇分别梯度稀释到50、25、12.5、6.25、3.125 μL/mL。在无菌培养皿中加人100 μL孢悬液和100 μL梯度稀释的精油，倒入20 mL未凝固PDA培养基，充分混合。每组3皿，28 ℃培养。实验中以95%乙醇和无菌水为对照。48 h后，观察测试菌种的生长情况，以完全没有菌落生长的最低浓度作为该精油的最小抑菌浓度(MIC)。

1.3.5 最小杀菌浓度(MBC)的测定

取2.3.4没有长菌的平皿继续培养48 h后，取出观察以完全没有菌生长的最低浓度作为该精油的最小杀菌浓度(MBC)。

1.4 数据处理

利用Microsoft Excel和SPSS 22.0软件对实验数据进行处理和方差分析。

2 结果分析

2.1 分离鉴别霉菌结果

在含水量为20%的玉米样品，放置时间在2～8 d均出现黑色的菌落，在放置6 d时只有黑色菌落出现，在放置4 d出现绿色的菌落。含水量为50%的玉米样品，放置时间在2～8 d均有黑色的菌落和黄色菌落产生，在放置第4 d时出现不同于水分含量为20%的深绿色菌落。

如图1和图2所示，将分离得到的5株优势菌株进行PCR扩增，同时获得的ITS序列在NCBI中进行BLAST对比，5株菌株分别与Aspergillusniger(黑曲霉，MH511143.1)、Penicilliumchrysogenum(产黄青霉，MT141145.1)、Aspergillusflavus(黄曲霉，MT645322.1)、Aspergillusversicolor(杂色曲霉，MN416222.1)和Penicilliumexpansum(青霉，MK850332.1)同源性最高，相似度达到100%。黑曲霉生长快速，在粮食、植物及土壤中均可发现，极易通过空气进行扩散，尤其是粮食水分含量高时易引起霉变。黄曲霉易在发霉的玉米和花生中发现，可以产生黄曲霉毒素危害人类及牲畜的健康。杂色曲霉产生杂色曲霉素(ST)普遍污染大米、玉米和小麦。青霉菌常见于变质的果蔬、肉食和衣服上和粮食中，大多数为灰绿色，包括能够产生青霉素的产黄青霉。

图1 玉米中分离的霉菌

图2 扩增产物琼脂糖凝胶电泳图

2.2 单种精油抑菌结果

图3表示6种精油对这5种霉菌均具有一定的抑菌作用，其中丁香精油和大蒜精油的抑菌作用最明显、可以看到出现很明显的抑菌圈。薄荷、花椒和八角茴香精油对除黑曲霉外的霉菌表现出一定的抑制作用，橙皮精油对除黑曲霉和黄曲霉外的霉菌表现出一定的抑制作用。

注：a花椒精油；b丁香精油；c八角精油；d薄荷精油；e大蒜精油；f橙皮精油。图3 单种精油对霉菌的抑菌效果

由表1可知，黑曲霉对丁香精油高度敏感；对大蒜精油中度敏感；对花椒、八角茴香、橙皮、薄荷精油不敏感；杂色曲霉对花椒、丁香、八角茴香精油高度敏感，对薄荷、大蒜、橙皮精油中度敏感；青霉菌对丁香、花椒、大蒜、薄荷、八角茴香精油高度敏感，对橙皮精油中度敏感；产黄青霉对丁香、大蒜精油高度敏感，对花椒、八角茴香、薄荷、橙皮精油中度敏感；黄曲霉对花椒、丁香、八角茴香精油高度敏感，对薄荷、大蒜精油中度敏感，对橙皮精油不敏感。同时上述霉菌对丙酸处理组均为高度敏感。

表1 单种精油对霉菌的抑菌圈直径

通过对单种精油抑菌结果的分析，丁香、八角茴香、薄荷、花椒、大蒜精油及丙酸对5种玉米霉菌效果较好，但大蒜精油味道重且较难去除，会影响玉米的后续加工，而丙酸具有强烈刺激性气味，对皮肤有刺激性，对容器、加工设备也有腐蚀性，因此不选择大蒜精油和丙酸，而选择丁香、花椒、八角茴香、薄荷精油进行复合，并进行抑菌实验，这四种精油及丙酸的综合抑菌能力大小依次为丁香>花椒>丙酸>八角茴香>薄荷，而且丁香精油和花椒精油的抑菌效果优于八角茴香和薄荷精油，因此选择这四种精油以MBC为精油浓度进行复合，得到复合精油1(丁香∶花椒∶八角茴香∶薄荷的体积比=1∶1∶1∶1)和复合精油2(丁香∶花椒∶八角茴香∶薄荷的体积比=2∶2∶1∶1)。

2.3 MIC的测定结果

精油MIC测定结果如表2所示。丁香精油对黑曲霉、杂色曲霉、青霉和产黄青霉的MIC为12.5μL/mL，对黄曲霉的的MIC为25 μL/mL。八角茴香对杂色曲霉和黄曲霉的MIC为25 μL/mL，对青霉的MIC为12.5 μL/mL。花椒精油对青霉的MIC为12.5 μL/mL。大蒜精油对青霉的MIC为3.125μL/mL，对产黄青霉的MIC为12.5 μL/mL。薄荷精油对青霉的MIC为25 μL/mL。

表2 精油对5种霉菌的MIC测定

2.4 MBC的测定结果

精油对5株霉菌的MBC的测定结果如表3所示。丁香精油对黑曲霉和青霉的MBC为25 μL/mL、对杂色曲霉MBC为12.5 μL/mL，对产黄青霉和黄曲霉的的MBC为50 μL/mL。八角茴香对杂色曲霉和黄曲霉的MBC为50 μL/mL，对青霉的MBC为12.5 μL/mL。大蒜精油对青霉的MBC为12.5 μL/mL，对产黄青霉的MBC为25 μL/mL。薄荷精油对青霉的MBC为50 μL/mL。

表3 精油对5种霉菌的MBC测定

2.5 复合精油抑菌实验结果

复合精油1和复合精油2对5种霉菌表现出明显的抑制作用，尤其是对青霉菌，在培养基上没有明显的菌落生长；对产黄青霉，黑曲霉，黄曲霉和杂色曲表现一定的抑制作用，有较少的菌落出现在培养基上。同时由表4可知，5种霉菌均对复合精油1和复合精油2为高度敏感。抑菌能力大小依次为青霉菌>黄曲霉>产黄青霉>黑曲霉>杂色曲霉。而且复合精油对青霉的抑菌效果最佳，且这两个复合精油抑菌效果基本相近，但精油抑菌成本较高，考虑到经济原因，因此选择等体积比复合丁香，花椒，八角茴香，薄荷精油开发玉米防霉剂。

表4 复合植物精油对霉菌抑菌圈直径

2.6 复合精油与单种精油实验结果对比分析

将上述实验所得到的复合精油1和复合精油2与单种精油抑菌圈判定的敏感度进行比对，由表5可发现5种霉菌对复合精油1和复合精油2的敏感度均为高度敏感，且均高于霉菌对单种精油的敏感度。由于精油经过一定体积比的复合后可以起到协同增效的作用[26]，因此得到比单种精油更好的抑菌效果。

表5 复合植物精油与单种植物精油抑菌效果比较

3 结论

通过研究丁香，花椒，薄荷，八角茴香，大蒜，橙皮精油对黑曲霉、黄曲霉、杂色曲霉、青霉菌、产黄青霉的抑菌效果，发现丁香、八角茴香、薄荷、花椒、大蒜精油及丙酸对上述霉菌抑菌作用明显，且抑菌能力大小依次为丁香>花椒>丙酸>八角茴香>薄荷，但大蒜精油味道重且较难去除，丙酸对皮肤有刺激性，对容器、加工设备有腐蚀性，因此选择丁香、花椒、八角茴香、薄荷精油进行复合精油抑菌实验。同时通过霉菌对相同剂量的单种植物精油和复合植物精油敏感程度的结果进行比对，得出复合精油1(丁香∶花椒∶八角茴香∶薄荷的体积比=1∶1∶1∶1)对黑曲霉、杂色曲霉、青霉菌、产黄青霉、黄曲霉的抑菌效果均比单种精油的抑菌作用明显。可为复合植物精油作为玉米及储粮天然防霉剂的研究提供参考。