刘 鹏, 周松峰, 房 磊

(吉林化工学院1，吉林 132022) (吉林农业科技学院2，吉林 132101)

毛梾(Cornuswalteri)是一种山茱萸科的落叶乔木，毛梾又称梁木、油树，在我国的分布较为广泛，常分布于山西、河北以及长江以南等区域[1]。随着对其化学成分的研究，毛梾的药用价值进入研究人员视野，逐渐引起人们关注[2]。毛梾的果子可做酒，并且根、果均可入药，毛梾种子含油率为36%～38%，毛梾籽油属半干性油，其中含有硬脂酸1.6%，十六碳烯酸3.2%、油酸33.6%、亚油酸38%[3，4]。

在食用方面，毛梾籽油在我国进行食用已经延续百年时间了，在主要油料地区当地居民将其作为食用油进行食用，并且具有无化肥农药、天然健康、不饱和脂肪酸含量高等特点[5]。毛梾籽油的食用价值已经远高于花生和大豆，当前我国已经将毛梾籽油列为食品商用油，其具有极高的药用价值和营养价值[6]。并且具备降低血脂、血压，起到治疗心血管疾病的作用，如冠心病、高血压等[7]。同时毛梾籽油具有较强的抗氧化作用，其含有的黄酮类物质具备较好的热稳定性，具有清除自由基的能力[8]。鉴于毛梾籽油的营养价值较高，及具有较强的抗氧化能力，本文采用响应面优化提取毛梾籽油，并且结合有氧运动设计实验，研究对脂肪肝大鼠肝组织生化指标的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

毛梾籽，市售；正己烷(分析纯)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、丙二醛(MDA)，谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)；高脂饲料(包括15%猪油、3%胆固醇、2%鱼肝油、80%基础饲料)。

DX-30B型粉碎机、SA224S-CW型电子天平、GT SONIC-D3型超声波清洗机、TG-29G型离心机、DHG-9035AE型鼓风干燥箱，DZKW-D-2型恒温水浴锅。

1.2 实验动物及伦理要求

SPF级雄性SD大鼠50只，体重(150±5) g，许可证(SYXK(粤)2020-0240)。

在实验中根据动物实验的伦理要求，规范实验人员伦理行为的操作规程，充分考虑动物的利益，善待动物，减轻或减少动物的应激、疼痛和伤害，尊重动物生命，制止针对动物的野蛮行为、采取痛苦最少的方法处置动物，减少动物不必要的处死和处死的数量。

1.3 方法

1.3.1 毛梾籽油的提取

将毛梾籽用清水洗净，放置于干燥箱内，在60 ℃干燥2 h，粉碎，过80目筛，备用。称取10 g毛梾籽粉末，放置于烧瓶中，加入50 mL的正己烷，将其放置在超声波清洗器中，在一定超声功率、提取温度、提取时间下进行提取，提取结束后，减压蒸馏出提取溶剂，并在50 ℃下干燥至恒重得到毛梾籽油[9，10]。

Y=(m/M)×100%

式中：Y为毛梾籽油得率/%；m为毛梾籽油质量/g；M为毛梾籽粉末质量/g。

1.3.2 毛梾籽油精炼

精炼：1)脱胶：将毛梾籽油放入烧杯中，将其放入恒温水浴锅中，温度设置到50 ℃，保温60 min，加入100 mL的蒸馏水，之后搅拌15 min，静置存放2 h，使油脂与胶质分离，取上层油脂。2)碱炼：取脱胶的毛梾籽油，放入烧杯中，加入1mol/L KOH，并且不断搅拌，保证混合均匀，静置2 h后离心，取上层油脂。3)脱色：取脱胶碱炼的毛梾籽油，加入活性白土脱色，加入量为毛梾籽油质量的5%，搅拌1 h，离心分离，取上层油脂。最后，得到精炼的毛梾籽油。

1.4 单因素实验

在提取温度50 ℃，提取时间60 min，设定不同超声功率200、250、300、350、400 W；在超声功率350 W，提取时间60 min，设定不同提取温度30、40、50、60、70 ℃；在超声功率350 W，提取温度50 ℃，设定不同提取时间40、50、60、70、80 min，研究对毛梾籽油得率的影响。

1.5 响应面法优化毛梾籽油提取工艺

在单因素实验的基础上，以毛梾籽油得率(Y)为指标，选择超声功率(X1)、提取温度(X2) 、提取时间(X3)为因素，进行响应面实验设计，实验因素与水平见表1。

表1 Box-Behnken实验设计因素水平

1.6 动物分组及运动方案

选取SPF级雄性SD大鼠50只，体重在(150±5) g，分成5个小组，每组10只大鼠，将其分为对照组A、模型组B、有氧运动组C、毛梾籽油组D、毛梾籽油结合有氧运动组E。

A组每天喂养普通饲料，其他4组喂养高脂饲料，大鼠正常饮水，实验总共6周。建模2周时，除A组外其余4组喂养高脂饲料，大鼠体重增加，建立脂肪肝模型。第3周开始，C组开始进行游泳运动20 min，之后每周逐步递增5 min；D组对其进行灌胃1 mg/g的毛梾籽油； E组在按照C组进行游泳运动之外，每天灌胃1 mg/g的毛梾籽油，并观察每天大鼠的变化。6周实验结束后，将大鼠麻醉，取腹部腹主动脉取血，4 ℃以下4 000 r/min离心10 min，吸取上清液，测血清AST、ALT水平。在大鼠肝部边缘1 cm处切取一小块肝组织，在4 ℃条件下，称取0.2 g肝组织，加入预冷后的生理盐水至总体积2 mL，制备10%肝组织匀浆，以3 500 r/min，离心10 min，取上清液测试肝组织SOD、MDA、GSH-Px水平[11，12]。

1.7 统计学分析

本文使用SPSS 18.0软件进行数据分析，数据均使用均值±标准差来表示，采取组间进行对比，P<0.05表示具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 超声功率、提取温度、提取时间对毛梾籽油得率的影响

由图1可知，随着超声功率的增加，毛梾籽油得率先上升后下降，当超声功率为350 W时得率达到最高。主要因为超声功率增加可以使空化作用增加，使得毛梾籽内的细胞破碎速度加快，使得油脂更容易析出。因此，选择最佳超声功率为350 W。

图1 超声功率、提取温度、提取时间对毛梾籽油得率的影响

随着温度的升高，毛梾籽油得率先上升后下降，当提取温度为50 ℃时，得率达到最高。这是因为温度的升高，油脂会更容易析出到提取溶剂中，同时温度过高会导致提取溶剂正己烷挥发，得率降低。因此，最佳提取温度为50 ℃。

随着提取时间的延长，毛梾籽油得率逐渐升高，当提取时间为60 min时得率几乎不变。考虑到实验成本以及经济效益，选择最佳提取时间为60 min。

2.2 响应面法实验结果与分析

在单因素实验的基础上，确定各因素最佳水平值范围，采用响应面法实验设计，以毛梾籽油得率(Y)为指标，设计Box-Benhnken实验中心组合实验。响应面分析方案与结果见表2。

表2 Box-Behnken实验设计与结果

通过表2分析响应面结果可知，采用Design-Expert软件对表3组实验数据进行多元回归拟合，建立回归模型，以毛梾籽油得率为响应值，得到多元回归方程：

Y=37.25+0.61X1+0.93X2+0.87X3-0.11X1X2-0.053X1X3-0.077X2X3-1.59X12-1.90X22-0.89X32

由表3分析可知：模型P=0.000 1<0.01，失拟项P=0.842 8>0.05，该模型拟合良好，实验误差小，R2=0.999 6，Adj.R2=0.999 0也表明模型拟合程度较好，实验精度和重复性较好，适用于优化毛梾籽油提取工艺。

表3 响应面回归模型ANOVA分析结果

此外，超声功率、提取温度、提取时间影响都达到了极显著水平(P<0.01)，X1X2达到极显著水平(P<0.01)、X2X3达到显著水平(P<0.05)，超声功率、提取温度、提取时间各因素的二次项对得率影响极显著(P<0.01)。

通过分析可知，毛梾籽油提取的最佳条件，超声功率为358.74 W、提取温度为52.30 ℃、提取时间为64.72 min、时毛梾籽油的得率为37.62%。考虑日后的实际操作便利，将提取工艺参数修正，超声功率为360 W、提取温度为52 ℃、提取时间为65 min。选取修正后的工艺参数组合做3次平行实验，得出毛梾籽油的平均得率为37.36%，与预测值接近。因此修改的工艺参数具备实用价值。

2.3 毛梾籽油结合有氧运动对脂肪肝大鼠肝组织SOD、GSH-Px 、MDA的影响

从表4得出，B组大鼠SOD水平与A组相比明显降低(P<0.05)，E组大鼠SOD水平与B组相比明显升高(P<0.05)，E组大鼠SOD水平与A组相比不具有显著性差异(P>0.05)；B组大鼠GSH-Px水平与A组相比明显降低(P<0.05)，E组大鼠GSH-Px水平与B组相比明显升高(P<0.05)，E组大鼠GSH-Px水平与A组相比不具有显著性差异(P>0.05)；B组大鼠MDA水平与A组相比明显升高(P<0.05)，E组大鼠MDA水平与B组相比明显降低(P<0.05)，E组大鼠MDA水平与A组相比不具有显著性差异(P>0.05)。大鼠喂养高脂饲料建立脂肪肝模型使得肝细胞组织中的SOD和GSH-Px活性显著降低，脂质过氧化产物MDA含量显著增高，脂质过氧化产物具有细胞毒性，可以对肝细胞造成损伤。有氧运动训练可以提高机体的抗氧化酶系统的能力，可以使机体自由基代谢能力加强，同时提高了氧运输系统的能力，使得肝组织相对缺氧程度变小，进而使抗氧化系统得以增强，可以更有效的清除产生的自由基。脂肪肝模型大鼠体内存在着氧自由基蓄积和氧化应激反应，并且在脂肪肝及其并发症的发生起到重要作用。由于毛梾籽油含有黄酮类物质具有较强的抗氧化能力，可以清除大量自由基，使MDA含量降低，恢复SOD和GSH-Px的活性，同时结合有氧运动可以对脂肪肝大鼠的氧自由基蓄积和氧化应激反应起到缓解作用，并且两者结合的效果要优于单一效果。

表4 毛梾籽油结合有氧运动对脂肪肝大鼠肝组织SOD、GSH-Px 、MDA的影响

2.4 毛梾籽油结合有氧运动对脂肪肝大鼠肝组织ALT与AST的影响

从表5得出，B组大鼠ALT水平与A组相比明显升高(P<0.05)，E组大鼠ALT水平与B组相比明显降低(P<0.05)，E组大鼠ALT水平与A组相比不具有显著性差异(P>0.05)；B组大鼠AST水平与A组相比明显升高(P<0.05)，E组大鼠AST水平与B组相比明显降低(P<0.05)，E组大鼠AST水平与A组相比不具有显著性差异(P>0.05)。ALT、AST常用来反映肝功能具有代表性的检测指标，同时也是肝功能损伤的检测指标。ALT主要存在肝细胞浆中，一旦肝细胞出现坏死或者损伤，ALT水平就会升高，而AST主要存在于肝细胞的线粒体内，同样如果肝细胞发生损伤或者坏死，AST水平也会升高。大鼠建立脂肪肝模型使得肝组织内的细胞出现损伤，导致ALT与AST水平升高。灌胃毛梾籽油后，并且结合有氧运动，使得ALT与AST水平下降，肝功能逐渐得到恢复，肝损伤得到缓解，并且两者结合的效果要优于单一效果。

表5 毛梾籽油结合有氧运动对脂肪肝大鼠肝组织ALT与AST的影响

3 结论

本研究以毛梾籽为主要原料，采用超声波辅助法提取毛梾籽油，利用单因素和响应面实验优化提取毛梾籽油工艺，结合实际操作，将提取工艺参数修正为，超声功率为360 W、提取温度为52 ℃、提取时间为65 min。得出毛梾籽油的平均得率为37.36%，与预测值接近。因此修改的工艺参数具备实用价值。同时研究其结合有氧运动对脂肪肝大鼠肝组织生化指标的影响，结果表明，毛梾籽油含有黄酮类物质具有较强的抗氧化能力，可以清除大量自由基，使MDA含量降低，恢复SOD和GSH-Px的活性，并且毛梾籽油和有氧运动单独作用都可以对脂肪肝大鼠的氧自由基蓄积和氧化应激反应起到缓解作用，使得ALT与AST水平下降，肝功能逐渐得到恢复，肝损伤得到缓解，并且毛梾籽油结合有氧运动的效果要优于两者单独作用。