刘英玉，卢 玮，胥 兰，朱明月，蒋金豆，朱梦含，苏战强

（新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐 830052）

新疆双峰驼产于新疆准噶尔盆地和塔里木盆地边缘及天山南北坡的荒漠草场、荒漠草原草场地带。按其产地外貌特征，大体可分为南疆型和北疆型2个类型，主要分布在北疆的阿勒泰地区、塔城地区、昌吉、哈密地区的巴里坤县和南疆的阿克苏地区、和田地区、巴音郭楞蒙古自治州[1-2]。骆驼养殖的最大价值就是生产驼奶，发展特种乳产业对促进农牧民增收致富、带动地方经济发展、丰富乳制品市场、增强国民体质具有积极意义[3]。但是目前双峰驼乳房疫病方面的情况报道较少。金黄色葡萄球菌是一种可引起人类和动物的食源性致病菌，在自然界中广泛存在，在动物源中传播常引起严重的疾病，如乳房炎、败血症、关节炎等，在人中引起肠炎、呕吐、毒素休克综合征等[4]。金黄色葡萄球菌致病力的强弱与其产生的毒素有关，主要包括肠毒素、溶血毒素、杀白细胞毒素、黏附素、中毒性休克综合征毒素等，这些毒力因子具有不同的生物学特性，因而具有不同的致病特征[5]。本研究调查新疆塔城地区双峰驼乳中金黄色葡萄球菌的污染情况、毒力基因、spa分型及耐药情况，为新疆双峰驼乳中金黄色葡萄球菌的流行病学提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试剂7.5%氯化钠肉汤和Baird-Parker琼脂、营养琼脂、营养肉汤购自青岛海博生物技术有限公司；金黄色葡萄球菌显色培养基购自法国科玛嘉公司；DNA marker、2×TaqMasterMix、核酸染料、琼脂糖和TAE均购自北京鼎国昌盛有限公司。

1.2 仪器AL204-IC电子天平购自梅勒特-托利多仪器有限公司；BCD-219D冰箱购自青岛海尔股份有限公司；生物安全柜购自美国LABCONCO公司；LDZX-50 KB立式压力蒸汽灭菌锅购自上海申安医疗器械厂；DHP-9162电热恒温培养箱购自上海一恒科学仪器有限公司；DYCP-31 DN水平电泳槽和DYY-6D型电泳仪电源、DYCP-31 DN稳压稳流电泳仪均购自北京市六一仪器厂；CT018926基因扩增仪和GELDOCXR凝胶成像系统均购自美国BIO-RAD公司；KD210-AN美的微波炉购自佛山市顺德区美的微波电器制造有限公司。

1.3 菌株和样品来源金黄色葡萄球菌质控菌株ATCC 29213购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。样品采集自新疆塔城地区骆驼养殖场的50份乳样。

1.4 金黄色葡萄球菌分离鉴定乳样中金黄色葡萄球菌的分离鉴定按照国家标准GB 4789.4-2016[9]进行操作。挑取疑似菌落进行水煮法提取DNA作为模板。采用PCR检测金黄色葡萄球菌耐热核酸酶基因nuc，引物序列见表1。反应体系：2×TaqMaster Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 8.2 μL。反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环，72℃最后延伸10 min。进行1%琼脂糖凝胶电泳判定。

表1 本研究所用引物Table 1 The primers used in this study

1.5 MRSA菌株鉴定PCR扩增耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mecA[6]基因进行鉴定。引物序列见表1，反应体系：2×TaqMaster Mix 12 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 10 μL。反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，47℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃最后延伸10 min。进行1%琼脂糖凝胶电泳判定。

1.6 毒力基因的检测对分离鉴定的金黄色葡萄球菌参照文献[7]进行肠毒素sea、seb、和sec，纤连蛋白结合蛋白fnbB，溶血毒素hla、hlb，黏附素凝聚因子clfa，杀白细胞素pvl，毒素休克综合征毒素tst9种毒力基因的PCR扩增，引物序列见表1。反应体系：2×TaqMaster Mix 12 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 10 μL。反应程序为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，毒力基因的引物退火温度见表1，72℃延伸35 s，共35个循环；72℃再延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳后进行判定。

1.7 spa分型检测spa分型参照http: //www.seqnet.org网站进行检测，引物序列如表1。反应体系与1.5一致。反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性45 s，60℃退火45 s，72℃延伸90 s，共30个循环；72℃再延伸10 min后保存于16℃。进行1%琼脂糖凝胶电泳判定，并送北京擎科生物公司进行测序，测序结果在CDC spa分型网站https://cge.cbs.dtu.dk/services/spatyper/进行分析。

1.8 药敏实验（K-B纸片扩散法） 9大类15种抗生素（氨苄西林、环丙沙星、诺氟沙星、红霉素、克拉霉素、米诺环素、四环素、青霉素G、苯唑西林、庆大霉素、大观霉素、万古霉素、替考拉宁、头孢西丁、复方新诺明）纸片均购自杭州滨河微生物试剂有限公司。

按照美国临床与实验室标准（CLSI）推荐的K-B纸片扩散法进行药敏实验：将保存于-20℃冰箱中的阳性菌株与营养肉汤按1∶9比例进行复苏，于37℃培养箱里过夜培养。将菌液于分光光度计OD625处测得吸光度值为0.08～0.10，即为0.5麦氏浊度。先将涂布棒于酒精灯外焰上消毒以确保无菌，用移液枪吸取100 μL菌液，涂布棒冷却后将菌液均匀涂布于MH琼脂平板上。待菌液晾干后将镊子消毒后夹取药敏纸片贴在MH琼脂平板上，每个平板最多贴5种抗生素药敏纸片，然后将平板倒置放于37℃恒温培养箱中培养16～18 h后观察结果。采用游标卡尺在黑色背景下测量抑菌圈的直径，依据CLSI判定标准将药敏结果按照R（耐药）、I（中介）、S（敏感）进行记录（表3）。

2 结果与讨论

2.1 金黄色葡萄球菌的分离鉴定按照国家标准GB 4789.4-2016方法对采集的50份乳样进行分离培养和PCR扩增保守基因nuc鉴定，共分离出2株金黄色葡萄球菌，分离率为4.00%。PCR结果可知，nuc的目的片段是223 bp，mecA的目的片段是162 bp（图1）。2株金黄色葡萄球菌的mecA基因是阴性，均不是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

图1 PCR检测金黄色葡萄球菌和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌保守基因nuc和mecA基因的电泳结果Fig.1 The electrophoretic results of nuc and mecA genes in S. aureus and methicillin resistant S. aureus were detected by PCR

在新疆脱贫攻坚战中，大力推进农牧民增收致富的其中一项措施就是发展骆驼奶制品，但是双峰驼奶制品的微生物污染检测报道较少。本实验从50头份驼乳中分离鉴定出2株金黄色葡萄球菌，分离率为4.00%，金黄色葡萄球菌是引起临床上骆驼金黄色葡萄球菌病的主要病原[8-9]。在养殖环节中，骆驼患有金黄色葡萄球菌病会出现摩擦木桩、墙壁、圈舍和同群骆驼，随后在皮肤表面会出现米粒大小的脓疱，个别在患病骆驼的眼睛一侧出现脓性病变，造成骆驼失明，甚至造成眼球脱出[8]。目前关于骆驼乳房炎病的研究报道很少，本研究在驼乳中分离鉴定的金黄色葡萄球菌，可以判定存在骆驼乳房炎病的感染。

2.2 毒力基因的检测分离鉴定的2株金黄色葡萄球菌进行9种毒力基因检测。结果可知，hla的目的片段是209 bp，hlb的目的片段是309 bp，clfa的目的片段是292 bp，pvl的目的片段是433 bp，sea的目的片段是560 bp，seb的目的片段是404 bp，sec的目的片段是297 bp，tst的目的片段是180 bp，fnbB的目的片段是524 bp（图2）。2株菌株检测均存在hla、hlb、clfa毒力基因，且A37菌株还编码了pvl毒力基因。菌株A37的spa型是t549，重复序列是14-44-13-17-17-17-23-18-17，菌株A41的spa型是t435，重复序列是04-20-69-31-70-13-17-16-16-16（表2）。

图2 PCR检测金黄色葡萄球菌毒力基因hla、hlb、clfa、pvl、sea、seb、sec、fnbB、tst的电泳结果Fig.2 The electrophoretic results of virulence genes hla, hlb, clfa, pvl, sea, seb, sec, fnbB, tst in S. aureus’s were detected by PCR

金黄色葡萄球菌致病力的强弱与其编码的毒素蛋白有关，主要有肠毒素、溶血毒素、杀白细胞毒素、黏附素、中毒性休克综合征毒素等，这些蛋白具有不同的生物学特性，因而具有不同的致病特征[5]，本研究检测的2株菌均存在黏附基因clfa、溶血毒素hla和hlb，据报道clfa与奶牛乳房炎发展的严重程度相关[11]。clfa还能结合宿主细胞的细胞外基质，使细菌完全被宿主的细胞外基质包裹从而逃脱宿主免疫系统的监视[12]。黏附素主要包括纤连蛋白结合蛋白和凝集因子，主要结合宿主的纤连蛋白和纤维蛋白原，是一种重要的细菌表面识别黏附基质分子。2株金黄色葡萄球菌菌株存在溶血毒素hla和hlb。α-溶血素（Hla）在细菌侵入机体后帮助病菌逃避机体免疫并在致病过程起重要作用，能够溶解红细胞及除中性粒细胞之外的一系列白细胞[13-14]。β-溶血素（beta hemolysin, Hlb）属于鞘磷脂酶，能破坏细胞膜结构导致红细胞裂解[15-16]。杀白细胞素（panton-valentine leukocidin, pvl）是由金黄色葡萄球菌产生的与严重侵袭性感染相关的双组分成孔毒素[17]，是导致人类化脓感染和坏死性肺炎的原因之一[18]，其中1株菌编码杀白细胞素。研究表明杀白细胞素可加重炎症反应。杀白细胞毒素量足够多时可激活PMNs和巨噬细胞，促进更多白细胞产生的白三烯B4和颗粒酶（β-葡萄糖醛酸酶，水解酶和溶菌酶）和活性氧代谢物，可能导致更多的炎症细胞浸润[19-20]。刘义臣等[21-22]研究结果表明，死亡鸭胚中金黄色葡萄球菌毒力基因情况是肠毒素H型hla、hlb的检出率很高，分别为81.25%、71.88%，其次clfa和pvl的检出率为78.13%和6.25%。根据菌株编码的毒力基因情况预测驼乳中金黄色葡萄球菌是具有致病性。

2.3 耐药性检测从驼乳中分离鉴定的2株金黄色葡萄球菌进行9大类15种抗生素的药敏纸片，结果如表3。2株菌对多肽类的万古霉素和替考拉宁产生了耐药，同时对氨基糖苷类的大观霉素也产生了耐药；其中A37菌株还对环丙沙星、青霉素G、四环素产生了耐药，2株菌株都是多重耐药菌株，其中A41是3重耐药菌株，A37是6重耐菌株。

表3 骆驼乳中2株金黄色葡萄球菌的耐药性调查结果Table 3Drugresistance of twostrains of Staphylococcus aureus in camel milk

2株金黄色葡萄球菌均对甲氧西林耐药，但对万古霉素和替考拉宁、大观霉素耐药；其中1株还对环丙沙星、青霉素G、四环素耐药，均是多重耐药菌株。已报道新疆地区存在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的流行，且表现出多重耐药性，但不同地区和不同动物源金黄色葡萄球菌的耐药情况有所不同[10]。骆驼和驼乳中金黄色葡萄球菌病的发生情况不明，抗生素治疗时要防止耐药性的产生。新疆驼乳中存在来源不同的金黄色葡萄球菌，具有多重耐药性和潜在致病性，应加强驼乳食品的微生物安全检测，保障消费者的身体安全。