罗小宁，刘洁文，张羽，王祥财，涂福平

（赣南医学院第一附属医院，江西 赣州341000）

肺癌是常见的呼吸系统恶性肿瘤，其发病率、病死率高，严重威胁人类健康[1]。而非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）是肺癌的亚型，占肺癌的80%～85%[2]。在现有治疗模式下，肺癌患者的总体治愈率< 20%，晚期患者5年生存率<5%，因此，探索新的治疗模式具有重要意义[3]。随着肿瘤免疫理论逐渐走向成熟，免疫治疗作为一种新兴的治疗模式，在肿瘤治疗中展现出较大潜力。目前，免疫检查点抑制剂的应用已在晚期肺癌治疗中取得突破性进展[4]。自然杀伤（natural killer, NK）细胞是机体固有免疫系统的一种效应细胞，具有强大的抗肿瘤、抗感染等作用，是机体免疫的作用屏障[5-6]。研究发现，细胞因子可选择性地提高NK 细胞数量和抗肿瘤功能的有效性[7]。解聚素- 金属蛋白酶17（a disintegrin and metalloprotease 17, ADAM17）可介导黏附因子、细胞因子、生长因子等多种膜分子水解脱落，在调节肿瘤细胞的增殖、凋亡、黏附、转移等过程中发挥重要作用[8]。研究发现，ADAM17 在非小细胞肺癌组织中高表达，并且与淋巴结转移密切相关[9]。肿瘤细胞的免疫逃逸往往是肿瘤复发、转移的总根源，而NK 细胞在宿主抵抗肿瘤生长、转移的免疫反应中起关键作用[10]。本研究将通过研究NSCLC A549 细胞株中ADAM17 下调对NK 细胞杀伤作用的影响，以期为NSCLC 免疫治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

人NSCLC A549 细胞株（货号：HZ-H122）购自美国ATCC 细胞库，胎牛血清（货号：FBS500-S）购自澳大利亚AusGeneX 公司，RPMI-1640 培养液（货号：GMS12052.4.1）购自美国GENMED 公司，Lipofectamine 2000 转染试剂（货号：11668019）购自美国Invitrogen 公司，Ficoll 密度梯度分离液试剂盒、NK 细胞激活扩增试剂盒（货号：P1114、TBDNKKIT）购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司，磁性激活细胞分离（MACS）试剂盒（货号：130-097-240）购自德国Miltenyi Biotec 公司，实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）试剂盒（货号：K1002S）购自美国Promega 公司，nonsense siRNA、ADAM17 siRNA 与ADAM17、GAPDH 引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，ADAM17 抗体、γ 干扰素（IFN-γ）抗体、颗粒酶B（GraB）抗体、穿孔素（PFP）抗体、GAPDH 抗体（货号：ab57484、ab25101、ab4059、ab7203、ab181602）购自美国Abcam 公司，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔（货号：0295G-HRP）购自美国Santa 公司，CCK-8 试剂（货号：CK-04）购自日本同仁化学研究所，MIR-162-PC/MIR-262-PC 型恒温培养箱购自日本松下株式会社，荧光定量PCR仪（型号：ABI 7500）购自美国Applied Biosystems 公司， 酶标仪、 化学发光成像系统（型号：MODEL550、ChemiDocXRS）购自美国Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与分组 将A549 细胞培养于含10%胎牛血清、100 u/mL 青霉素、100 u/mL 链霉素的RPMI 1640 培养基中，37℃、5%二氧化碳培养箱培养，细胞融合率达到70%～80%时，用胰蛋白酶消化、传代培养。

取对数期A549 细胞以1×104个/孔的密度接种于96 孔培养板，分为正常对照组、阴性对照组和ADAM17 下调组。其中正常对照组A549 细胞不进行转染，阴性对照组、ADAM17 下调组A549 细胞使用Lipofectamine 2000 转染试剂分别转染nonsense siRNA、ADAM17 siRNA。

1.2.2 NK细胞制备 取健康成年捐赠人外周静脉血10 mL 于肝素抗凝管中，加预冷PBS，混匀后采用Ficoll 密度梯度离心法离心外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs），预 冷PBS 洗涤，按照MACS 试剂盒操作步骤分离NK 细胞（CD56+CD3-），使用NK 细胞激活扩增试剂盒激活NK 细胞，使用含10%胎牛血清、500 u/mL 重组白细胞介素2 的RPMI 1640 培养基进行培养，保持细胞浓度为1×106个/mL。

1.2.3 qRT-PCR 检测各组A549 细胞ADAM17 mRNA 表达 将细胞培养48 h，收集细胞，提取总RNA，逆转录合成cDNA，采用qRT-PCR 检测ADAM17 mRNA 表达水平，内参基因为GAPDH。反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性10 s，55℃退火30 s，72℃拉伸1 min，共34 次循环。ADAM17正向引物：5′-ATCAAACCTTTCCTGCG-3′，反向引物：5′-CAAACCCATCCTCGTCCA-3′，分别为17 和18 bp；内 参GAPDH 正向引物：5′-GAAGGT‐GAAGGTCGGAGTC-3′，反向引物：5′-GAAGAT‐GGTGATGGGATTTC-3′，分别为19 和20 bp。Ct 值为扩增产物的荧光信号达到临界阈值时对应的循环数，相对表达量以2-ΔΔCt法表示。

1.2.4 Western blotting 检测各组A549细胞ADAM17蛋白表达 使用蛋白提取试剂盒提取各组细胞总蛋白，使用BCA 蛋白测定试剂盒测定蛋白浓度并定量。电泳分离等量蛋白质并转至PVDF 膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST 封闭1 h，分别加入AD‐AM17 抗体、GAPDH 抗体（1∶500），4℃孵育过夜，TBST 洗涤后加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1∶5 000），室温孵育1 h，免疫反应化学发光法显色，Tanon 600 图像分析系统拍摄图像并分析条带灰度值，目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参GAPDH 灰度值。

1.2.5 NK细胞杀伤活性检测 以正常对照组、阴性对照组和ADAM17 下调组A549 细胞为靶细胞，NK 细胞为效应细胞，在正常对照组、阴性对照组和ADAM17 下调组基础上按20∶1 的效靶比加入100 μL NK 细胞，同时设立相应的空白正常对照组、NK 细胞正常对照组和A549 细胞正常对照组。孵育24 h 后，每孔加入CCK-8 试剂20 μL，继续孵育4 h 后，在酶标仪450 nm 处检测每孔光密度（optical density, OD）值，计算杀伤活性。杀伤活性（%）=1-（实验组OD 值-NK 细胞正常对照组OD 值）/（A549 细胞正常对照组OD 值-空白正常对照组OD值）×100%。

1.2.6 Western blotting 检测各组细胞IFN-γ、GraB、PFP 蛋白表达 将各组细胞按20∶1 的效靶比加入100 μL NK 细胞，培养48 h，收集细胞，使用蛋白提取试剂盒提取各组细胞总蛋白，使用BCA 蛋白试剂盒测定蛋白浓度并定量。电泳分离等量蛋白质并转至PVDF 膜上，用含5%脱脂奶粉的TBST 封闭1 h，分别加入IFN-γ 抗体、GraB 抗体、PFP 抗体、GAPDH 抗体（1∶500），4℃孵育过夜，TBST洗涤后加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1∶5 000），室温孵育1 h，免疫反应化学发光法显色，Tanon 600 图像分析系统拍摄图像并分析条带灰度值，目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/内参GAPDH 灰度值。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 24.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用方差分析，进一步两两比较用SNK-q检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞ADAM17 mRNA相对表达量比较

正常对照组、阴性对照组、ADAM17 下调组细胞中ADAM17 mRNA 相对表达量分别为（1.03±0.12）、（1.01±0.10）、（0.65±0.07），经方差分析，差异有统计学意义（F=28.096，P=0.000），正常对照组与阴性对照组细胞ADAM17 mRNA 相对表达量比较，差异无统计学意义（P>0.05），ADAM17 下调组较正常对照组、阴性对照组降低（P<0.05）。

2.2 各组细胞ADAM17蛋白相对表达量比较

正常对照组、阴性对照组、ADAM17 下调组细胞中ADAM17 蛋白相对表达量分别为（0.86±0.11）、（0.83±0.13）、（0.38±0.07），经方差分析，差异有统计学意义（F=38.389，P=0.000），正常对照组与阴性对照组A549 细胞中ADAM17 蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（P>0.05），ADAM17 下调组较正常对照组、阴性对照组降低（P<0.05）。见图1。

图1 各组A549细胞中ADAM17蛋白表达

2.3 各组NK细胞对A549细胞的杀伤活性比较

正常对照组、阴性对照组、ADAM17 下调组NK 细胞对A549 细胞的杀伤活性分别为（30.52±2.85）%、（32.07±2.99）%、（46.88±3.31）%，经方差分析，差异有统计学意义（F=52.399，P=0.000），正常对照组与阴性对照组NK 细胞对A549 细胞的杀伤活性比较，差异无统计学意义（P>0.05），ADAM17 下调组较正常对照组、阴性对照组升高（P<0.05）。

2.4 各组细胞中IFN-γ、GraB、PFP蛋白相对表达量比较

各组细胞中IFN-γ、GraB、PFP 蛋白相对表达量比较，差异有统计学意义（P<0.05），正常对照组与阴性对照组细胞中IFN-γ、GraB、PFP 蛋白相对表达量比较，差异无统计学意义（P>0.05），ADAM17 下调组较正常对照组、阴性对照组升高（P<0.05）。见表1 和图2。

表1 各组细胞中IFN-γ、GraB、PFP蛋白相对表达量比较 （n=6，±s）

表1 各组细胞中IFN-γ、GraB、PFP蛋白相对表达量比较 （n=6，±s）

组别正常对照组阴性对照组ADAM17下调组F 值P 值IFN-γ 0.31±0.09 0.36±0.08 0.88±0.12 62.055 0.000 GraB 0.30±0.06 0.28±0.06 0.74±0.10 70.744 0.000 PFP 0.36±0.09 0.37±0.08 0.80±0.14 33.308 0.000

图2 各组细胞中IFN-γ、GraB、PFP蛋白表达

3 讨论

NSCLC 是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率、病死率在全球范围内均居恶性肿瘤首位，严重影响患者的生命健康[11]。NSCLC 发病隐匿，多数患者确诊时已处于癌症中晚期，只能尽量延长其生存时间[12]。目前，手术切除已非最佳治疗方式，而化学治疗在杀伤肿瘤细胞的同时也在杀死健康细胞，严重的毒性反应会导致患者免疫功能降低，严重影响患者的生存质量[13]。因此，寻找一种疗效较好、不良反应少的方法对提高NSCLC 患者生存率、延长生存期、改善生活质量具有重要意义。

肿瘤存在免疫监视、免疫逃逸等机制，使肿瘤细胞在机体中避开免疫系统的清除，隐匿地发生、发展。而免疫治疗是一种通过重新激活抵抗癌症的免疫系统，以达到治疗的目的[14]。NK 细胞是具有直接杀伤功能的天然免疫效应细胞，通过识别细胞固有表达受体，无需致敏即可特异性识别病变细胞，发挥快速杀伤病变细胞的功能[15]。由于NK 细胞具有异体细胞回输、体内存活周期短、无细胞因子风暴、不可预期风险低等优势，其在肿瘤免疫治疗中具有巨大的应用潜力[16]。增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用是免疫治疗的主要手段之一，YAO 等[5]研究表明，罗格列酰胺是癌症免疫疗法中有希望的治疗候选药物，可以通过阻止对NK 细胞介导的杀伤的自噬免疫抵抗发挥作用。

ADAM17 是一种膜结合蛋白酶，通过对一些与细胞膜结合的细胞因子、配体的膜外功能区进行剪切，使这些细胞因子、配体被活化而调控下游信号转导途径，从而影响肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移[17]。TSUKERMAN 等[18]研究表明，ADAM17缺陷患者的NK 细胞杀伤力增加。MISHRA 等[19]研究表明，抗ADAM17 单克隆抗体MEDI3622 与肿瘤细胞结合后，能增强NK 细胞与肿瘤细胞结合，进而增强人NK 细胞的IFNγ 的释放。本研究结果显示，ADAM17 下调组ADAM17 mRNA 及蛋白相对表达量较正常对照组、阴性对照组降低，同时NK 细胞对A549 细胞的杀伤活性较正常对照组、阴性对照组升高，提示下调A549 细胞中ADAM17 表达水平可能有助于NK 细胞识别，并结合A549 细胞发挥杀伤作用。有研究发现，NK 细胞中含有大量GraB、PFP蛋白，活化后的NK细胞不仅产生IFN-γ，还会释放GraB、PFP 蛋白，在天然免疫及杀死靶细胞过程发挥重要作用[20]。本研究发现，成功下调A549 细胞中ADAM17 表达水平后，细胞IFN-γ、GraB、PFP 蛋白相对表达量均升高，推测下调A549细胞ADAM17 表达水平后，增强了NK 细胞对A549细胞的识别，导致NK 细胞活化释放IFN-γ、GraB、PFP 增多，增强NK 细胞对A549 细胞的杀伤作用。

综上所述，NSCLC A549 细胞株中ADAM17 下调可以增强NK 细胞的杀伤作用，抑制肿瘤免疫逃逸，这可能为NSCLC 免疫治疗提供新靶点。