刘瑞芳, 王傲泽，陈 秋，王艺伟,张晗妍

(1.西北农林科技大学动物科技学院，陕西 杨凌 712100; 2.富平县市场监督管理局)

1 细胞融合技术的重要性

细胞融合也称细胞杂交，是在自然条件或人工诱导下，两个及以上的细胞或原生质体发生膜融合、胞质融合、核融合形成双核或多核细胞的过程。早在19世纪30年代，Muller就观察到肿瘤细胞在体内自发融合产生多核细胞。自20世纪50年代，短短30年间，细胞融合技术完成了从病毒诱导异种细胞融合到PEG法诱导细胞融合再到电脉冲诱导细胞融合的巨大飞跃，融合方法得到了不断的革新和完善, 融合率也逐步地提高。

细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一, 目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域，并已在农业、医药等领域取得了开创性的研究成果,在免疫学、发育生物学、遗传学特别是克隆抗体和动植物远缘杂交育种、基因图谱的绘制等诸多方面, 都具有重要的意义。 PEG诱导鸡血细胞融合实验被作为细胞生物学本科实验的一项重要内容，具有操作简单、实验材料容易获取等优点，但也具有较为突出的缺点——细胞融合率低，在很大程度上影响了教学效果。改进和完善细胞融合的条件，提高细胞融合率，能大大提高学生的学习积极性，有助于学生科学探究能力的形成。

2 细胞融合的方法

目前，细胞融合方法主要包括：(1)物理法如电融合诱导法、激光融合法，空间细胞融合技术、离子束细胞融合技术以及非对称细胞融合技术。(2)化学法如盐类融合法、高钙和高pH值融合法、聚乙二醇融合法(PEG法)。(3)生物法如仙台病毒(SeV)诱导法、水疱性口炎病毒(VSV)诱导法。

聚乙二醇融合法(PEG法)诱导鸡血细胞融合的融合率相对较高，实验成本低廉且广泛应用于实验研究中。椭球形的鸡红细胞因其运动时所受到的阻力较大而体型较小，融合率不及兔红细胞与蟾蜍红细胞，但便于取血、观察以及融合率的计算。因此，实验主要对提高聚乙二醇诱导鸡血细胞融合率的条件进行优化和探究。

细胞融合过程大致可分为细胞的接触、细胞质膜的融合、细胞质的重组和遗传物质的选择四个部分。基于细胞膜的流动性，经过PEG分子的诱导，通过热力学力和渗透压导致细胞膜紧密接触，带有负极性的PEG分子借氢键结合水分子，以致细胞脱水，使细胞质膜的脂类分子发生疏散和重组，相邻的重排质膜在修复时因膜脂双层的相互亲和与表面张力相互结合。这一过程受到PEG分子量和浓度、融合温度和时间以及pH值的影响,且融合温度与融合时间对细胞融合率的影响远小于聚乙二醇浓度的影响。

3 目前的研究成果

3.1 不同PEG的分子量与浓度对鸡血细胞融合率的影响

PEG的分子量越大，浓度越高，对细胞膜的破坏越强烈，对细胞的毒性也越大，且 PEG 浓度过高时细胞反应液体环境粘滞度升高，可能会阻碍细胞融合。因此，PEG 浓度对鸡红细胞的融合率影响较大，其次为融合温度、反应时间。大部分的研究采用了分子量为4000的PEG进行实验，探究适合的PEG浓度。华小黎的研究认为，在其他试验条件相同的情况下，使用PEG 4000，浓度为45% PEG融合率较高。而仇燕则认为PEG4000浓度为35% 时融合率最高。此外，刘哲等人使用PEG1500，通过调整其他条件，使融合率最高达到25.47%；侯元通过调整pH 值，实现了以分子量为8000的PEG作为诱导剂的蟾蜍血细胞融合，且在相同实验条件下，PEG 8000的作用超过PEG 4000。因此，认为目前最适合鸡血细胞融合的PEG分子量与浓度暂不明确，分子量为2000、4000、6000、8000的不同浓度的PEG都有可能促成细胞融合，需要进一步的探索和验证，研究PEG分子量、浓度及其互作效应对细胞融合率的影响。

3.2 不同融合温度对鸡血细胞融合率的影响

在一定范围内，细胞质膜的流动性会随着温度的升高而增强，流动性的增强可促进细胞膜的融合，提高融合率。但高温过度也可使细胞因不能承受高温而失去活性，导致融合率降低。刘哲等人的研究结果表明，在融合温度为35 ℃、37 ℃、39 ℃时，与PEG1500作用10 min，39 ℃时细胞融合率最高, 达25.47%。而王惠等人在融合时间15 min、浓度为50%的PEG4000 条件下, 融合温度23 ℃的融合率最低, 30 ℃的融合率次之, 37 ℃的融合率最高, 温度升高至44 ℃时, 融合率反而下降。仇燕等人使用50% PEG4000，在不同温度 (30 ℃、35 ℃、37 ℃、39 ℃) 水浴锅中融合20 min，细胞融合率随着反应温度的升高而增加, 37 ℃时细胞融合率最高达20.15%, 并发现有少量细胞的细胞膜破裂,39 ℃时融合率反而有所下降。然而，从实际课堂中的实验结果来看，上述温度下的融合结果并不理想。考虑到鸡的体温高于40 ℃，认为鸡血细胞可以承受高于39 ℃的融合温度，应尝试探索更高的融合温度能否进一步提高融合率。

3.3 不同融合时间对鸡血细胞融合率的影响

王惠使用PEG4000,在37 ℃水浴锅内温浴5 min、10 min、15 min，结果显示融合率不随时间的推移发生显著变化。而仇燕则认为在35 ℃时，浓度为35%的PEG 4000 ，细胞融合的最适融合时间为 40 min，时间过长或过短均会降低融合率。刘哲的实验设置温度为37 ℃, PEG1500作用时间分别为2 min、5 min、10 min、20 min，结果表明融合10 min的细胞融合率最大, 可达22.61%, 但有一部分细胞已经破碎，10 min后细胞融合率不随时间推移而发生显著变化。以上的实验结果存在较大差异，不同浓度、不同分子量的PEG以及不同温度都可能影响鸡血细胞融合的最适时间。细胞的靠近、接触、融合都需要一定时间，但随着融合时间的增长，PEG对细胞的破坏随之增强，融合时间过长可能导致细胞膜破裂，细胞形状发生改变。此外，综合考虑PEG的分子量和浓度与融合时间，高 PEG 浓度、短孵育时间的方式优于低 PEG 浓度、长孵育时间的方式，这是因为长时间孵育造成了细胞与PEG分离。因此，我们认为融合时间可能取决于PEG的分子量和浓度，考虑融合时间与融合温度之间的互作。

4 小结

PEG介导的细胞融合法是最为经济、简单的细胞融合技术，但由于其效果受多种因素影响，实验结果通常并不理想。PEG 法诱导细胞融合既是细胞生物学中一项重要研究技术，也是细胞生物学本科实验课程中的一项重要内容，为了提高细胞融合效果，使学生彻底掌握这项重要技术。